3.內(nèi)標(biāo)(Internal Control,IC)
內(nèi)標(biāo)是指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子。內(nèi)標(biāo)有兩種形式,一種是使用天然樣品中含有的內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo),另一種是人工添加的內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)的最大特點(diǎn)是與靶序列共同擴(kuò)增,而其他的對(duì)照都是獨(dú)立擴(kuò)增。
3.1 內(nèi)參基因
通常它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,在檢測(cè)基因的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。內(nèi)參基因通常是持家基因(house-keeping gene)因?yàn)槠浔磉_(dá)水平受環(huán)境因素影響較小,而且在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)變化很小。常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
內(nèi)參基因的優(yōu)點(diǎn)是與樣品中的靶基因經(jīng)歷全相同的處理程序,可以監(jiān)控采樣,運(yùn)輸,核酸提取和擴(kuò)增的全部過程。缺點(diǎn)是不同物種,不同生理狀態(tài)下,不同組織中的內(nèi)參基因存在一定的差異。如果樣品類型是口腔液,咽拭子等樣品,內(nèi)參基因的量很低可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成立。如果檢測(cè)的是環(huán)境樣品則內(nèi)參基因可能全失效。
3.2人工內(nèi)標(biāo)
添加一種不會(huì)干擾靶序列擴(kuò)增的人工合成的內(nèi)標(biāo)。現(xiàn)在國(guó)外的診斷試劑盒大部分都會(huì)將內(nèi)標(biāo)直接添加在反應(yīng)液中與模板一起擴(kuò)增,但是這樣的內(nèi)標(biāo)不能監(jiān)控采樣,運(yùn)輸和核酸提取的過程。
還有另一種形式的內(nèi)標(biāo),使用人工合成的假病毒,在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內(nèi)標(biāo),這樣就可以監(jiān)控樣品的提取到擴(kuò)增的過程。但是由于是人工添加到樣品中,仍然不能監(jiān)控胞內(nèi)細(xì)菌病毒的釋放情況。