PCR反應(yīng)條件包括溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。
基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40~60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100~300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法, 除變性溫度外,退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
變性溫度與時(shí)間
變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,93℃~94℃足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間,但溫度不能過高,因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。
退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間
退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜的多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間,取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。
引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-(5~10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合, 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30~60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。
延伸溫度與時(shí)間
Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性:70~80℃ 150核苷酸/s/酶分子,70℃ 60核苷酸/s/酶分子,55℃ 24核苷酸/s/酶分子,高于90℃時(shí), DNA合成幾乎不能進(jìn)行。
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。
PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,一般1kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時(shí)間1min是足夠的。3~4kb的靶序列需3~4min;擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增,延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。