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提高RT-PCR反應(yīng)體系的靈敏度方式解讀(一)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-08-20  來源:上海撫生實(shí)業(yè)有限公司
核心提示:1、分離高質(zhì)量RNA成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA應(yīng)保-證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等,以及盡可能減


1、分離高質(zhì)量RNA

成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA應(yīng)保-證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等,以及盡可能減少基因組DNA污染。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的大值。

2、使用無RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。不管是M-MLV還是AMV,在本身的聚合酶活性之外,都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈,并降解RNA:DNA復(fù)合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會(huì)大有裨益。

編輯:songjiajie2010

 
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