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PCR污染該如何避免?

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-08-19  來源:網(wǎng)絡(luò)
核心提示:進行PCR操作時,操作人員應(yīng)該嚴格遵守一些操作規(guī)程,最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。1.劃分操作區(qū):目前,普

進行PCR操作時,操作人員應(yīng)該嚴格遵守一些操作規(guī)程,最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

1.劃分操作區(qū):

目前,普通PCR尚不能做到單人單管,實現(xiàn)完全閉管操作,但無論是否能夠達到單人單管,均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行,PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行:

(1)標本處理區(qū),包括擴增摸板的制備。

(2)擴增區(qū),包括反應(yīng)液的配制和PCR擴增。

(3)產(chǎn)物分析區(qū),凝膠電泳分析,產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。

(4)各工作區(qū)要有一定的隔離,操作器材專用,要有一定的方向性。如:標本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

切記:產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

2.分裝試劑:

PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA:

(1) PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水。

(2) 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制。

(3)引物和dNTP應(yīng)分裝儲存,分裝時應(yīng)標明時間,以備發(fā)生污染時查找原因。

3. 實驗操作注意事項:

盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一。因此,不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真,在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意:

(1)戴一次性手套,若不小心濺上反應(yīng)液,立即更換手套。

(2)使用一次性吸頭,嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染。

(3)避免反應(yīng)液飛濺,打開反應(yīng)管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。

(4)操作多份樣品時,制備反應(yīng)混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應(yīng)的精確度。

(5)最后加入反應(yīng)模板,加入后蓋緊反應(yīng)管。

(6)操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照,即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性,又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。

(7)盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染,最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用,不能交叉使用,尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)。

(8)重復(fù)實驗,驗證結(jié)果,慎下結(jié)論。

編輯:songjiajie2010

 
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關(guān)鍵詞: 污染
 

 
 
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