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PCR反應(yīng)問題解答(一)無擴增條帶

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-07-24  來源:上海撫生實業(yè)有限公司
核心提示:聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點。

PCR反應(yīng)過程常出現(xiàn)各種問題,下面對問題做詳細(xì)匯總解答:

1. 無擴增條帶

(1)酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當(dāng)而失活,往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。

(2)模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。

(3)變性溫度是否準(zhǔn)確:PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符,過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活;過低則模板變性不全。

(4)反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶,應(yīng)在未加Taq酶以前,將反應(yīng)體系95℃加熱5-10分鐘。

(5)引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化,或因儲存條件不當(dāng)而失活。

(6)引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。

(7)DNA凝膠電泳時加入陽性對照,確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。

編輯:songjiajie2010

 
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