(1)DEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性。
(2)DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物,因而使用時需小心。
(3)試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度然后劇烈振蕩10分鐘再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。
(4)但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。
實驗步驟如下:
1. 取50~100mg的組織加入1 ml Trizol試劑,用勻漿器打勻(Trizol 先放于冰上)。
2. 將勻漿室溫放置5 min。
3. 加入200 μl 氯仿劇烈震蕩混勻30s,冰上靜置3 min。
4. 12000 rpm,4℃ 離心15 min。
5. 將上清液小心轉移到新的1.5 ml離心管中(取400 μl ),加入等量體積的異丙醇,上下顛倒幾次混勻,室溫下放置15 min。(此步中留意:不要吸取任何中間層物質,寧缺勿濫。)
6. 12000 rpm,4℃ 離心15 min 。
7. 小心移去上清液,防止RNA沉淀丟失。
8. 用70%乙醇(DEPC處理的水配制)洗滌1次,加入700 μl乙醇,將RNA沉淀彈起,漂洗。(此時RNA是不溶解的)
9. 8000 rpm,室溫離心10min。
10. 盡可能徹底地吸走上清,防止RNA沉淀丟失。
11. 真空離心干燥3~5分鐘,或放在室溫下使乙醇完全揮發(fā)掉。
12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如發(fā)現沉淀難溶,68 ℃處理10 min。
13. RNA檢測
(1)測定樣品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μg/ ml RNA計算RNA的產量。OD260/OD280在1.8-2.0 。
(2)進行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳確定RNA的完整性和污染情況。
低得率:A.樣品裂解或勻漿處理不徹底;B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。