DNA序列测定是分子生物学领域最重要的技术之一，是了解基因结构和功能的基础。DNA测序技术的不断完善和仪器自动化程度的不断提高，为大型基因组测序奠定了基础，当今大多数蛋白质序列都是通过基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。DNA测序方法主要有双脱氧链终止法（Sanger法）和化学降解法（Maxam-Gilbert法）。目前不管是传统的手工测序法，还是仪器自动测序法均使用前者，而仪器自动测序法以其快速、准确等优点得以广泛应用。我室于1995年，引进美国PE公司的373A型DNA序列测定仪，仪器专管共用，两年来为校内、外科研人员提供测序服务，现将该仪器使用中的一点体会报告如下。

1、测序原理和特点

373A型DNA测序仪使用双脱氧链终止法（Dye-primer或Dye-terminator）进行DNA测序反应，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，实时检测自动读序。该仪器与其它仪器相比较，其显著特点是它能用4种不同的荧光分子分别标记4种反应引物（Dye-primer法）或4种dNTP（Dye-terminator法）。4个反应分开进行，产物合并在一个泳道中电泳分离，根据每条区带的荧光不同加以识别读序，这样不但可提高每次分析样品的数量（373A型每次可测定36个样品），又克服了泳道间差异造成的读序误差。与传统的手工测序比较：①安全，无污染；用荧光素代替同位素，避免了放射性同位素的污染和对人体的危害；②模板用量大大减小，单链DNA模板用量为0.4μg，双链DNA质粒模板用量为0.8μg，PCR产物用量为5ng～20ng；③测序长度大大提高，一般可达450bp～500bp。

2、体会

2.1　模板纯化是前提　DNA测序所用的模板可以是质粒DNA，也可以是PCR产物，但使用高质量的模板是测序成功的前提。DNA纯化的方法很多，如聚乙二醇沉淀法、琼脂糖凝胶电泳法、氯化铯梯度离心法、高效液相色谱法（HPLC法）和一次性微柱法等。用这些方法纯化的DNA都可用于DNA测序，但从我们实验结果来看，HPLC法和微柱法（如Promega公司的Wizard Plus Miniprep DNA Purification System）效果最好。为了保证测序的成功率，测序模板纯化后，必须先进行1%琼脂糖凝胶电泳（凝胶中含0.5mg/L溴化乙锭，样品浓度为0.2g/L，上样量为1μl）鉴定其纯度，要求条带清晰，无杂带，无拖尾，否则应重新纯化，以保证测序的结果。

2.2　测序反应是关键　测序反应是DNA自动测序的第一步，也是测序成败的关键所在。符合测序要求的DNA模板，经过测序反应后,会形成数百条带有不同荧光的核苷酸链，且每条核苷酸链的碱基数只相差1个碱基。目前，我们使用的测序试剂为PE公司提供的DNA测序试剂盒（Dye-primer或Dye-ter-minator），其中每种试剂的浓度为产品的最佳组合，而且测序反应的条件（变性、退火、延伸的时间和温度）与试剂盒配套使用。这就必须按照试剂盒的要求控制好模板的浓度，即使纯度合格的DNA模板其浓度也很重要，单链DNA模板为0.10g/L，双链质粒模板为0.20g/L，PCR产物根据其片段的长度取适当的量，浓度过高或过低都会直接影响测序的结果。根据我们的使用情况，浓度太高时，电泳条带信号强，会出现平头峰，测序结果短（一般＜250bp），而且误差大；浓度过低时，电泳条带信号弱，噪声多，误差大，可信度差。在使用Dye-termina-tor法测序时（一般模板为PCR产物），除模板的纯度和浓度符合要求外，所用引物的纯度和浓度也很重要，引物应为测序级纯度，浓度应准确定量。

2.3　电泳条件是保证　前面已提到，测序反应产物经电泳分离后,实时进行自动读序，要使只差1个碱基的DNA链达到最佳分离，电泳的条件至关重要。373A型DNA测序仪使用的是尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为4.75%，恒功率（30W），这些条件相对固定，所以电泳的成败主要取决于凝胶的配制。一是电泳试剂的纯度。由于该系统是检测荧光信号，所以要求试剂不能含有杂质，我们使用Sigma公司的试剂和部分国产分析纯试剂，经实验证实可以达到实验的要求。二是凝胶配制。要求各种试剂的称量要准确，除凝胶浓度准确外，TBE缓冲液的配制尤为重要，否则会影响电泳结果，造成测序失败，这是由于TBE的离子浓度的高低可直接引起电泳时电压的升高或降低。三是灌胶要仔细。要防止产生气泡、波浪纹等而影响电泳分离。

总之，在使用全自动DNA测序仪时，模板的纯度和浓度、测序反应、电泳分离等环节都会影响测序的结果，任何一个环节出现问题，都会造成前功尽弃。根据我们的经验，在测序试剂盒质量有保证、仪器工作正常、实验人员精心操作的前提下，测序模板的纯度和浓度是测序成功的关键，测序失败往往是由于模板的纯度不够或浓度不准所致。两年来中我们测定了数百份样品，成功率达到88%。其中Dye-primer法测定的样品占95%，单链DNA模板单向测序可达700bp～800bp，双链质粒模板单向测序可达500bp～600bp。