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C18色譜柱的選用

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-09-13
核心提示:C18的選用主要考慮2個(gè)問題,即柱填料和柱規(guī)格對色譜柱的影響
 一、C18柱的選用

C18的選用主要考慮2個(gè)問題,即柱填料和柱規(guī)格對色譜柱的影響。

1.1 C18柱的填料對色譜柱的影響 

柱填料的物理性能對填料色譜行為有重要影響。填料主要的物理性能包括如下:顆粒度、孔徑、孔體積、鍵合相化學(xué)、含碳量及烷基化處理。

(1)顆粒度是指柱填料的顆粒直徑的大小。實(shí)際上色譜柱上所標(biāo)的粒徑是一個(gè)平均值。如粒徑“5μm”并不是柱中填料所有的顆粒直徑都是5μm,實(shí)際上有一個(gè)顆粒分布度。這種分布度對柱反壓及柱效有重要作用。一般來說,平均顆粒度越小,顆粒分布度越小,色譜柱效越高,反壓亦越高。目前C18柱填料粒徑在4~10μm之間

(2)孔徑是指填料顆粒間的孔間隙。一般所說的孔徑是指填料的平均孔徑。球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄,柱床結(jié)構(gòu)均勻,柱效高,重現(xiàn)性好;無定形填料平均孔徑分布較寬,柱床結(jié)構(gòu)不均勻,流動(dòng)相線性速度不均勻,譜帶擴(kuò)寬。平均孔徑的大小對分離大分子化合物有較大的影響,在分離含有較大分子的樣品時(shí)可能會(huì)有分子排阻效應(yīng),或產(chǎn)生吸附效應(yīng)從而影響定量的回收率及準(zhǔn)確度。因而在用反相色譜分離諸如蛋白或多肽樣品時(shí)應(yīng)考慮選用大孔徑(如30 nm)的反相柱填料?左w積作為硅膠多孔性的參數(shù),在分離分析較大分子化合物時(shí)可作參考,選用較大孔體積的反相柱填料。

(3)化學(xué)鍵合相填料在高效液相色譜法中占有極重要的地位。它可以鍵合極性較大的有機(jī)基團(tuán),采用極性較小的溶劑作流動(dòng)相。亦可鍵合極性較小的有機(jī)基團(tuán),選用極性較大的溶劑作流動(dòng)相。C18色譜柱是以硅烷化鍵合型(Si-O-Si-C)存在的,這類鍵合反應(yīng)目前應(yīng)用最為普遍。如以十八烷基三氯硅烷與全多孔型硅膠M-Porasil-C18反應(yīng)生成烷基化學(xué)鍵合相,商品名為M-Bondapak-C18。

(4)碳含量即填料中的含碳量。傳統(tǒng)的測量技術(shù)是將填料加熱到碳?xì)滏I斷裂,然后通過測定損失的重量或形成的二氧化碳來計(jì)算碳含量?梢酝ㄟ^增加碳鍵的長度或增加鍵合密度來增加碳含量。碳含量增加,柱子的保留值增加。鍵合相的色譜行為與鍵合密度有關(guān),也與硅膠的密度及填料的表面積有關(guān),填料的密度越高,填柱所需的硅膠量越多,柱子的含碳量也越高。如果用2種不同密度相同碳含量的填料填充柱子,其保留行為將明顯不同。因此,單獨(dú)以碳含量來預(yù)測色譜行為是不夠的。

(5)C18硅烷化試劑是一個(gè)大于2nm大分子,因此會(huì)與已鍵合在相鄰的硅醇基上的C18硅烷化試劑產(chǎn)生嚴(yán)重的立體位阻。其結(jié)果導(dǎo)致在硅膠表面有大量的殘留硅醇基沒有與硅烷化試劑反應(yīng),這些極性的硅醇基在一定色譜條件下會(huì)與堿性化合物相互作用引起峰形拖尾,從而可影響定量分析結(jié)果。這些問題在一定程度上可以通過烷基化處理加以克服。烷基化處理是在鍵合相上完成的獨(dú)立反應(yīng),以減少在硅膠表面的硅醇基。烷基化處理采用小分子(如三甲硅烷)的試劑,其空間位阻遠(yuǎn)小于C18基團(tuán)。大多數(shù)固定相僅有30%可覆蓋的鍵合位置。據(jù)報(bào)道,通過某些極活躍的化學(xué)試劑及特殊的反應(yīng)條件,最高的覆蓋量可達(dá)50%。很好地了解硅膠鍵合相的物理特性將有助于在高效液相色譜的反應(yīng)中選擇合適的色譜柱。表面上看C18柱雖然化學(xué)官能團(tuán)相同,而實(shí)際上不同品牌的C18柱性能可能有很大差別,從而產(chǎn)生不同的分離結(jié)果。

1.2 C18柱的規(guī)格對色譜柱的影響 

柱填料的選擇關(guān)系到色譜分離的可能性,而柱規(guī)格的選擇直接影響分析速度、分離能力、檢測能力及每次分析的溶劑消耗等。柱規(guī)格包括兩方面:柱內(nèi)徑和柱長度。柱內(nèi)徑,分析型一般為2~6 mm,制備型20 mm,大者可達(dá)80 mm;柱長度,分析型5~30 cm,制備型15~50 cm。一般來說,柱內(nèi)徑不影響分離度與分析時(shí)間的關(guān)系。今天,柱技術(shù)已發(fā)展到不同柱內(nèi)徑的柱子能夠具有相同的性能。不同內(nèi)徑的柱子又各具特點(diǎn),對相同的分析時(shí)間和分離度來說,內(nèi)徑大的柱子比內(nèi)徑小的柱子多消耗溶劑。另一方面,較小內(nèi)徑的柱子對相同的檢測信號(hào)來說所需樣品量亦較少。因此,在樣品量有限時(shí),可使用小內(nèi)徑柱。柱長度增加雖可改善分離效果,但阻力也隨之增加,必須提高入口壓力。柱壓是同時(shí)影響增加分離度和減少分析時(shí)間的主要障礙。分離度、分析時(shí)間及柱壓三者相互制約,選擇好其中兩者,則第3個(gè)因素也就選好了。長柱可以給出高分離度,短柱可提供快速分離,我們可以根據(jù)樣品情況去選用合適的色譜柱。

1.3 C18柱選用的基本原則 

(1)選用經(jīng)過烷基化處理封口的填料可防止堿性化合物的拖尾現(xiàn)象。

(2)選用含碳量高的柱子,增加保留值。

(3)選用較短的柱子(如15 cm,7.5 cm)。

(4)選用小顆粒度的填料。

(5)對分子量大的組分選用大孔徑填料的柱子。

編輯:songjiajie2010

 
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