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內(nèi)標(biāo)法or外標(biāo)法,如何選擇是有理由的

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2022-07-07
核心提示:色譜分析的重要作用之一是對(duì)樣品進(jìn)行定量,而色譜法定量的依據(jù)是組分的重量或在載氣中的濃度與檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)成正比。常見(jiàn)定量分析方法有面積歸一化法、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法。而大家最容易混淆莫過(guò)于內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法了,下面我們從以下3個(gè)方面分析一下它們的異同、優(yōu)缺點(diǎn)以及如何該如何選擇。
 

外標(biāo)法介紹與優(yōu)缺點(diǎn)


外標(biāo)法的定義

 

外標(biāo)法不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測(cè)樣品中,而是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定,把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。外標(biāo)物與被測(cè)組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度,分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接近,以利于定量分析的準(zhǔn)確性,是最常用的一種定量方法。

 

外標(biāo)法的種類

 

外標(biāo)法分為工作曲線法、外標(biāo)一點(diǎn)法。

 

工作曲線法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線,求出斜率、截距。在完全相同的條件下,準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液,根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度,或用回歸方程計(jì)算;

 

外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測(cè)定樣品溶液中i 組分的含量。將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣,測(cè)得峰面積的平均值,用下式計(jì)算樣品中i組分的量。

 

外標(biāo)法的具體作法

 

(1)用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列,在與欲測(cè)組分相同的色譜條件下,等體積準(zhǔn)確量進(jìn)樣,測(cè)量各峰的峰面積或峰高,用峰面積或峰高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線應(yīng)是通過(guò)原點(diǎn)的直線。若標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過(guò)原點(diǎn),說(shuō)明測(cè)定方法存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率即為絕對(duì)校正因子。

 

(2)當(dāng)欲測(cè)組分含量變化不大,并已知這一組分的大概含量時(shí),也可以不必繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,而用單點(diǎn)校正法,即外標(biāo)一點(diǎn)法。外標(biāo)一點(diǎn)法實(shí)際上是利用原點(diǎn)作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上的另一個(gè)點(diǎn)。因此,當(dāng)方法存在系統(tǒng)誤差時(shí)(即標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過(guò)原點(diǎn)),單點(diǎn)校正法的誤差較大。因此規(guī)定,y=ax+b(b的絕對(duì)值應(yīng)不大于100%響應(yīng)值是y的2%)。

 

外標(biāo)法的優(yōu)缺點(diǎn)(工作曲線法)

 

優(yōu)點(diǎn):繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后測(cè)定工作就很簡(jiǎn)單了,計(jì)算時(shí)可直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上讀出含量,這對(duì)大量樣品分析十分合適。特別是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制后可以使用一段時(shí)間,在此段時(shí)間內(nèi)可經(jīng)常用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行單點(diǎn)校正,以確定該標(biāo)準(zhǔn)工作曲線是否還可使用。


缺點(diǎn):ÿ次樣品分析的色譜條件(檢測(cè)器的響應(yīng)性能,柱溫度,流動(dòng)相流速及組成,進(jìn)樣量,柱效等)很難完全相同,因此容易出現(xiàn)較大誤差。另外,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時(shí),一般使用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品(或已知準(zhǔn)確含量的樣品),因此對(duì)樣品前處理過(guò)程中欲測(cè)組分的變化無(wú)法進(jìn)行補(bǔ)償。

 

 

 

內(nèi)標(biāo)法的介紹與優(yōu)缺點(diǎn)


內(nèi)標(biāo)法的定義

 

內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí),選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物(內(nèi)標(biāo)物是樣品中û有的組分),然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中,進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)。

 

內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)

 

優(yōu)點(diǎn):進(jìn)樣量的變化,色譜條件的微小變化對(duì)內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果的影響不大,特別是在樣品前處理(如濃縮、萃取,衍生化等)前加入內(nèi)標(biāo)物,然后再進(jìn)行前處理時(shí),可部分補(bǔ)償欲測(cè)組分在樣品前處理時(shí)的損失。若要獲得很高精度的結(jié)果時(shí),可以加入數(shù)種內(nèi)標(biāo)物,以提高定量分析的精度。

 

缺點(diǎn):選擇合適的內(nèi)標(biāo)物比較困難,內(nèi)標(biāo)物的稱量要準(zhǔn)確,操作較麻煩。使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)要測(cè)量欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的兩個(gè)峰的峰面積(或峰高),根據(jù)誤差疊加原理,內(nèi)標(biāo)法定量的誤差中,由于峰面積測(cè)量引起的誤差是標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的2-2,但是由于進(jìn)樣量的變化和色譜條件變化引起的誤差,內(nèi)標(biāo)法比標(biāo)準(zhǔn)曲線法要小很多,所以總的來(lái)說(shuō),內(nèi)標(biāo)法定量比標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的準(zhǔn)確度和精密度都要好。

 

選擇內(nèi)標(biāo)物的注意事項(xiàng)

 

1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì);

2.它必須完全溶于試樣中,并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離;

3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測(cè)組分;

4.色譜峰的λ置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的λ置相近,或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間。

 

 

 

 

如何選擇內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)


內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已,至于哪一種方法好與不好不能一概而論,做不同的分析,面對(duì)著不同的要求,再加上分析成本分析效率等等問(wèn)題,簡(jiǎn)單而有效進(jìn)行定量分析來(lái)滿足要求才是最重要的。
 

關(guān)于如何選擇內(nèi)標(biāo)法還是外標(biāo)法,我們摘取了幾λ網(wǎng)友討論的內(nèi)容,希望能給疑惑的朋友一些幫助:

 

No.01

 

“以前做過(guò)很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族±代化合物的常量定量分析,û有自動(dòng)進(jìn)樣器,用外標(biāo)法定量,確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差,結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實(shí),仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分析,首先我們的實(shí)驗(yàn)室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了,比如,襯管是否潔凈,玻璃棉的λ置是否合適恰當(dāng)(能否使樣品盡可能的汽化)、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對(duì)稱(也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配)、附近有û有其它色譜峰的干擾、選用什ô進(jìn)樣方式(如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣)等等因素的影響都需要考慮,如果這些因素都考慮了,按照GMP方法驗(yàn)證對(duì)于精密度的要求,同一樣品進(jìn)6針以上的RSD和配制6個(gè)樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求,那ô這個(gè)方法用外標(biāo)法就是完全適用的,但是前面的影響因素是一定要都考慮到的,否則談?wù)撨@個(gè)方法是否適用就有失偏頗了。
 

在做過(guò)的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當(dāng)中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗(yàn)證過(guò)的方法,內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有(他們用的都是自動(dòng)進(jìn)樣)精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求,當(dāng)一個(gè)方法能夠滿足測(cè)試要求的時(shí)候,無(wú)論內(nèi)標(biāo)外標(biāo),都是可行的,當(dāng)然有一個(gè)分析成本和分析時(shí)間的問(wèn)題,內(nèi)標(biāo)的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當(dāng)然要比外標(biāo)要高和麻煩一些了。而有些時(shí)候,可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響,達(dá)不到一定的要求,而還必須進(jìn)行定量分析,有時(shí)外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一些,這時(shí),你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了,可以排除手動(dòng)進(jìn)樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些δ知因素平行誤差的影響,這時(shí)內(nèi)標(biāo)可能就顯示出它的優(yōu)勢(shì)來(lái)了。”

 

No.02

 

“¥上已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)證的時(shí)候,當(dāng)同一樣品配制6個(gè)樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候,RSD都滿足1.5%的要求時(shí),也分為兩種情況,小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的結(jié)果小于1%,那這個(gè)方法就û有什ô可以懷疑的了;如果RSD的結(jié)果大于1%而在1.5%略低一些的范Χ活動(dòng)時(shí),這個(gè)方法的可行性就將受到質(zhì)疑,畢竟這是方法驗(yàn)證,你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了,如果排除掉以上的影響因素,RSD還是在1.5%附近,就要嘗試內(nèi)標(biāo)了,如果內(nèi)標(biāo)結(jié)果的RSD很好,就證明你的這個(gè)方法受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大,只能用內(nèi)標(biāo)了,或者干脆將原方法做大的變動(dòng),再嘗試用外標(biāo)法測(cè)試!

 

No.03

 

“對(duì)于微量分析,比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等,根據(jù)不同的限量標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多,RSD有時(shí)可以允許達(dá)到10%甚至更高,這時(shí)可能外標(biāo)法有更大的應(yīng)用空間!

 

No.04

 

“單從精密度方面去考慮,排除其它成本和效率的因素,個(gè)人認(rèn)為還是內(nèi)標(biāo)優(yōu)于外標(biāo)。曾經(jīng)做過(guò)一個(gè)中間體二氨基丙醇的常量定量分析,以二乙醇胺為內(nèi)標(biāo),RTX-5amine(堿改性)15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析,將配制好的控制溶液(含有內(nèi)標(biāo)物)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)6針,目的物(二氨基丙醇)與內(nèi)標(biāo)物(二乙醇胺)峰面積比率的RSD為0.18%,而只對(duì)這六針樣品的目的物峰(二氨基丙醇)面積求RSD,結(jié)果為0.71%,通過(guò)這一實(shí)例的結(jié)果大家就會(huì)發(fā)現(xiàn)到底哪個(gè)方法精密度更好了,當(dāng)然是內(nèi)標(biāo)更好了。當(dāng)然這個(gè)化合物的檢測(cè)方法最后根據(jù)上面的驗(yàn)證數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量都是可以的,實(shí)驗(yàn)室可以自由選擇。但內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實(shí)。”

 

綜上所述,如果應(yīng)用外標(biāo)法能夠滿足要求的話,當(dāng)然首選還是外標(biāo)法,畢竟簡(jiǎn)單而省事。對(duì)于精密度要求比較高、結(jié)果準(zhǔn)確度會(huì)產(chǎn)生重大影響、實(shí)驗(yàn)室條件不是很理想的等等條件下,用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。

 

但無(wú)論應(yīng)用那種方法,方法的驗(yàn)證和確認(rèn)都是很重要的,只要是按照程序經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和確認(rèn)的方法,都有其應(yīng)用的空間的。 

編輯:songjiajie2010

 
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