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科研干貨 | 紫外分光光度計(jì)操作步驟、常見問題和解決措施

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-06-28
核心提示:在使用“上了年紀(jì)”的紫外分光光度計(jì)時(shí),我們經(jīng)常會(huì)碰到一些讓人頭大的問題。不是光源不亮,就是不能歸零……這對(duì)頭發(fā)本就不“富
在使用“上了年紀(jì)”的紫外分光光度計(jì)時(shí),我們經(jīng)常會(huì)碰到一些讓人頭大的問題。不是光源不亮,就是不能歸零……
這對(duì)頭發(fā)本就不“富!钡目蒲腥藖碚f,更是雪上加霜!為了從根源上減少它故障的頻率,今天我們就全面地了解下紫外分光光度計(jì)!(文后附常見問題與解決措施)
紫外分光光度計(jì)

紫外分光光度計(jì)是廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等多個(gè)科學(xué)研究領(lǐng)域的儀器之一。紫外分光光度計(jì)儀器分析法是利用物質(zhì)分子吸收紫外可見光譜區(qū)輻射的一種儀器分析方法。其基本原理依據(jù)朗伯·比爾定律——光被透明介質(zhì)吸收的比例與入射光的強(qiáng)度無關(guān),光的吸收與吸收層厚度、溶液濃度、光吸收率成正比,可用下式表示:
A=k×b×c

(A為吸光度;k為摩爾吸光系數(shù);b為光程,即盛放溶液的液槽的透光厚度;c為溶液濃度。)


儀器結(jié)構(gòu)

紫外分光光度計(jì)由光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和信號(hào)顯示系統(tǒng)五大部分組成。


光源:是提供符合要求的入射光的裝置,有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。熱輻射光源用于可見光區(qū),一般為鎢燈和鹵鎢燈,波長(zhǎng)范圍是350nm~1000nm;氣體放電光源用于紫外光區(qū),一般為氫燈和氘燈,連續(xù)波長(zhǎng)范圍是180nm~360nm。
單色器:功能是將光源產(chǎn)生的復(fù)合光分解為單色光和分出所需的單色光束,它是分光光度計(jì)的心臟部分。

吸收池:又稱比色皿,供盛放試液進(jìn)行吸光度測(cè)量之用,其底及兩側(cè)為毛玻璃,另兩面為光學(xué)透光面,為減少光的反射損失,吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。根據(jù)材質(zhì)可分為玻璃池和石英池兩種,前者用于可見光光區(qū)測(cè)定,后者用于紫外光區(qū)。

檢測(cè)器:是將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)的裝置,測(cè)量吸光度時(shí),并非直接測(cè)量透過吸收池的光強(qiáng)度,而是將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為電流信號(hào)進(jìn)行測(cè)試,這種光電轉(zhuǎn)換器件稱為檢測(cè)器。

信號(hào)顯示系統(tǒng):是將檢測(cè)器輸出的信號(hào)放大,并顯示出來的裝置。

優(yōu)勢(shì)
可重復(fù)使用樣品;

可以快速進(jìn)行測(cè)量;

儀器使用操作簡(jiǎn)單;

數(shù)據(jù)分析操作簡(jiǎn)單;

產(chǎn)品成本、操作成本低。



局限性
雜散光。波長(zhǎng)選擇器并不完美,來自寬波長(zhǎng)范圍的少量光仍可能從光源傳輸,這可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的測(cè)量錯(cuò)誤。

光散射。這通常是由液體樣品中的懸浮固體引起的,這可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的測(cè)量誤差。比色皿或樣品中存在的氣泡會(huì)散射光,導(dǎo)致無法重現(xiàn)結(jié)果。

來自多個(gè)吸收物種的干擾。為了進(jìn)行適當(dāng)?shù)亩糠治,?yīng)將每種化學(xué)物質(zhì)從樣品中分離出來并單獨(dú)檢查。

組件的偏差。任何儀器組件未對(duì)準(zhǔn)定位,尤其是固定樣品的比色皿,都可能產(chǎn)生不可重復(fù)和不準(zhǔn)確的結(jié)果。

操作步驟

STEP 1:開機(jī)預(yù)熱
在儀器測(cè)試之前一定要進(jìn)行預(yù)熱,預(yù)熱的時(shí)間應(yīng)該大于20min。檢查樣品室中是否有遮光物,有則取出。

STEP 2:光源選擇
電源打開后,鎢燈會(huì)亮起。若在波長(zhǎng)200nm~290nm之間工作,則光源切換至氘燈;在波長(zhǎng)290nm~360nm之間工作,則要同時(shí)點(diǎn)亮氘燈和鎢燈。

STEP 3:波長(zhǎng)選擇
輸入所需波長(zhǎng)。

STEP 4:設(shè)備校準(zhǔn)
沒有開機(jī)自動(dòng)校準(zhǔn)功能的設(shè)備需按說明書手動(dòng)校準(zhǔn)。

STEP 5:開始測(cè)量
按START鍵開始測(cè)量,通常使用裝有蒸餾水的吸收池調(diào)零后放入樣品和參比樣進(jìn)行測(cè)試,并記錄測(cè)試結(jié)果。測(cè)定前要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的樣品濃度,讓反應(yīng)后的待測(cè)溶液的光吸收值位于0.3~0.7之間。否則,待測(cè)數(shù)據(jù)不能正確反映實(shí)際變化。如果不同樣品之間濃度差異較大,則在測(cè)定時(shí)應(yīng)先測(cè)定低濃度樣品(淺色),再定測(cè)高濃度樣品(深色)。

STEP 6:數(shù)據(jù)處理
定量測(cè)試時(shí)通常需要先測(cè)定若干個(gè)已知濃度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)樣品,根據(jù)其吸光值與濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

STEP 7:關(guān)機(jī)
測(cè)量完畢后取出吸收池,清洗并晾干后入盒保存。關(guān)閉電源,拔下電源插頭,在樣品室內(nèi)放入干燥劑,蓋上樣品室蓋,罩上防塵罩。

常見問題與解決措施

問題1:接通電源后,光源不亮
原因:①保險(xiǎn)管燒壞;②光源燈泡損壞。
措施:①更換保險(xiǎn)管;②檢查氘燈和鎢燈是否損壞,若損壞則及時(shí)更換燈泡。

問題2:吸光值出現(xiàn)負(fù)數(shù)
原因:沒做空白對(duì)照,樣品吸光值小于空白參比液。
措施:先做空白對(duì)照。

問題3:基線某段噪音很高
原因:濾光片受潮發(fā)霉,導(dǎo)致光能量損失嚴(yán)重。
措施:更換濾光片。

問題4:吸光值信號(hào)上下擺動(dòng)
原因:開關(guān)觸點(diǎn)因長(zhǎng)期氧化導(dǎo)致接觸不良。
措施:用金屬活化劑清洗按鍵觸點(diǎn)。

問題5:數(shù)字顯示不能歸零,同時(shí)圖線記錄基線位置偏高
原因:①信號(hào)處理板可能發(fā)生故障;②光電倍增管等老化,性能降低;③前置放大板出現(xiàn)故障,引起反饋量增大。
措施:①開機(jī)通電,先做記錄故障曲線,與原始記錄的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照,找出異同點(diǎn),并做定性定能分析。然后用一只同型號(hào)規(guī)格的新光電倍增管替換機(jī)上的光電管,再開機(jī)實(shí)驗(yàn),若結(jié)果記錄出來的圖線并沒有什么變化,則證明光電倍增管沒有老化變質(zhì)。②進(jìn)一步檢查信號(hào)處理板各元器件是否損壞,對(duì)影響靈敏度有關(guān)的電位器進(jìn)行檢測(cè),看數(shù)據(jù)是否正常。若都正常則說明信號(hào)處理板沒有故障。③對(duì)以上部件檢查都沒有問題,那么故障很可能發(fā)生在前置級(jí)放大板。應(yīng)采用模擬測(cè)試對(duì)前置放大板進(jìn)行測(cè)量,先利用直流穩(wěn)壓電源,把各供電電源加上,使其電路單獨(dú)工作,把信號(hào)發(fā)生器發(fā)出的信號(hào)加到輸入端,再用示波器接在輸出端測(cè)量輸出信號(hào)。將輸入信號(hào)與輸出信號(hào)對(duì)比,若結(jié)果波形相同,說明電路沒有故障。用相同方法對(duì)另一個(gè)帶驅(qū)動(dòng)器的開關(guān)管進(jìn)行測(cè)量,輸入端加入信號(hào)后,示波器若沒有測(cè)出輸出端信號(hào),則判斷開關(guān)管是損壞的,應(yīng)換上同一型號(hào)規(guī)格的新開關(guān)管。

開機(jī)前將樣品室內(nèi)的干燥劑取出,儀器自檢過程中禁止打開樣品室蓋。

比色皿內(nèi)溶液以皿高的2/3~4/5為宜,不可過滿以防液體溢出腐蝕儀器。測(cè)定時(shí)應(yīng)保持比色皿清潔,池壁上液滴應(yīng)用擦鏡紙擦干,切勿用手捏透光面。測(cè)定紫外波長(zhǎng)時(shí),需選用石英比色皿。

測(cè)定時(shí),禁止將試劑或液體物質(zhì)放在儀器的表面上,如有溶液溢出或其它原因?qū)悠凡叟K,要盡可能及時(shí)清理干凈。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將比色皿中的溶液倒盡,然后用蒸餾水或有機(jī)溶劑沖洗比色皿至干凈,倒立晾干。關(guān)掉電源,再將干燥劑放入樣品室內(nèi),并蓋上防塵罩,做好使用登記。


實(shí)驗(yàn)小百科
紫外分光光度計(jì)的發(fā)展歷史可追溯到幾百年前。1852年,Beer參考了Bouguer在1729年和Lambert在1760年所發(fā)表的文章,提出了分光光度的基本定律,即液層厚度相等時(shí),顏色的強(qiáng)度與呈色溶液的濃度成比例,從而奠定了分光光度法的理論基礎(chǔ),這就是著名的朗伯·比爾定律。1854年,Duboscq和Nessler等人將朗伯·比爾定律應(yīng)用于定量分析化學(xué)領(lǐng)域,并且設(shè)計(jì)了第一臺(tái)比色計(jì)。1918年,美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局制成了第一臺(tái)紫外分光光度計(jì)。此后,紫外分光光度計(jì)經(jīng)過不斷的改進(jìn),又出現(xiàn)自動(dòng)記錄、自動(dòng)打印、數(shù)字顯示等各種新的功能。這使得分光光度法的靈敏度和準(zhǔn)確度不斷提高,應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。


文章來源:網(wǎng)絡(luò) 
編輯:songjiajie2010

 
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