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X-Gal的作用機(jī)理及IPTG-X-gal平板制作方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-09-11  來源:實(shí)驗室資訊網(wǎng)
核心提示:  一、簡介X-Gal在beta;-半乳糖苷酶的催化下水解后呈藍(lán)色,因此常用于轉(zhuǎn)基因篩選試驗中,如藍(lán)白斑篩選或beta;-半乳糖苷酶的原位
 
 
  
一、簡介
X-Gal在β-半乳糖苷酶的催化下水解后呈藍(lán)色,因此常用于轉(zhuǎn)基因篩選試驗中,如藍(lán)白斑篩選或β-半乳糖苷酶的原位染色檢測實(shí)驗。藍(lán)白斑試驗中主要根據(jù)菌落呈現(xiàn)的顏色即可簡單的挑選出哪些是轉(zhuǎn)化子。
 
分子 式為C14H15BrClNO6,分子量為408.63,CAS Number 7240-90-6。
X–Gal是β–半乳糖苷酶(β–galactosidase)的底物,水解后呈藍(lán)色。基于這個特點(diǎn),pUC系列載體DNA(或其他帶有l(wèi)acZ 基因載體DNA)以lacZ 缺失細(xì)胞為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化時、或用M13噬菌體載體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染時,如果在平板培養(yǎng)基中加入X–Gal和IPTG,由于β–半乳糖苷酶的α–互補(bǔ)性,可以根據(jù)是否呈現(xiàn)白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑選出基因重組 體。
二、使用方法 :
首先把X-Gal配制成20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(-20℃避光保存),然后在100 ml的瓊脂培養(yǎng)基中,加入200 μl的上述溶液、100 μl的IPTG(24 mg/ml)和100 μl的Amp(100 mg/ml),制作成X-Gal、IPTG、Amp平板培養(yǎng)基。當(dāng)DNA片段插入至pUC系列載體(或其他帶有l(wèi)acZ、Amp基因載體),然后轉(zhuǎn)化至lacZ缺失細(xì)胞中后,涂布上述的X–Gal、IPTG、Amp平板培養(yǎng)基,可根據(jù)長出菌體的藍(lán)白色,而方便地挑選出基因重組 體(白色為具有DNA插入片段的基因重組體)。
三、注意事項 :
1、培養(yǎng)噬菌體時,Top agar中的添加量為:50 μl/3 ml(20mg/ml)。
2、含有X-Gal的培養(yǎng)基4℃避光保存,須在1~2周內(nèi)使用。
四、IPTG-X-gal 平板制作
1、IPTG儲液配置:一般將IPTG配成20%(m/V)(約0.84M)的母液。稱取0.5克 IPTG粉末,用2 ml蒸餾水將其完全溶解后,補(bǔ)加蒸餾水至2.5ml,用孔徑0.22 μm的小型注射型過濾器 (預(yù)先裝好濾膜滅菌備用)過濾除菌,-20 ℃凍存。
2、X-gal儲液配置:用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。稱取0.2克X-gal,加入10ml二甲基甲酰胺(DMF),溶解后保存于一小血清瓶內(nèi),裝有X-gal溶液的血清瓶須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞,并應(yīng)貯存于-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。
3、IPTG-X-gal平板制備:在含氨芐或卡那抗生素平板上,滴加40 µL的X-gal儲液及5 µL的IPTG儲液(怕體積過小影響涂布均勻,可適當(dāng)稀釋后再涂布),涂布均勻后晾干后使用。在臨使用前提前1h制備。
注:為方便實(shí)驗操作,試驗中也可以將X-gal和IPTG的儲備液按照菌液體積和平板數(shù)量計算好濃度,直接加入到準(zhǔn)備用于涂平板的細(xì)菌 培養(yǎng)液中,混勻后即可涂平板,這樣可以節(jié)省試驗時間。若經(jīng)過培養(yǎng)后長出的菌落藍(lán)白斑顯示的不夠明顯,可以將平板放入4度冰箱里,過一段時間以后菌落的藍(lán)白斑就顯示的比較清晰了。
 
編輯:songjiajie2010

 
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關(guān)鍵詞: X-Gal 平板制作方法
 

 
 
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