一、激光掃描共聚焦顯微鏡的基本原理和發(fā)展

科學(xué)研究工作對(duì)更高圖像分辨率的追求產(chǎn)生了激光掃描共聚焦顯微鏡。隨著免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，研究人員注意到，熒光顯微照片的分辨率較低，傳統(tǒng)的熒光顯微鏡使用場(chǎng)光源，因標(biāo)本鄰近結(jié)構(gòu)（細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)）產(chǎn)生的衍射光和散射光的干擾，使標(biāo)本中細(xì)微結(jié)構(gòu)的成像不夠清晰。激光共聚焦顯微鏡的主要原理是利用激光掃描束通過光柵針孔形成點(diǎn)光源，在熒光標(biāo)記標(biāo)本的焦平面上逐點(diǎn)掃描，采集點(diǎn)的光信號(hào)通過探測(cè)針孔到達(dá)光電倍增管（PMT），再經(jīng)過信號(hào)處理，在計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏上形成圖像。由于激光光源的光柵針孔和探測(cè)針孔對(duì)物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于光柵針孔和探測(cè)針孔，進(jìn)行點(diǎn)掃描時(shí)，掃描點(diǎn)以外的點(diǎn)不會(huì)成像，經(jīng)逐點(diǎn)掃描后才形成整個(gè)標(biāo)本的光學(xué)切片（Optic section）。

二、圖像激光掃描共聚焦顯微鏡的主要生物學(xué)應(yīng)用

1 、組織和細(xì)胞中熒光標(biāo)記的分子和結(jié)構(gòu)的檢測(cè)

標(biāo)本制備方法主要有免疫熒光組織和細(xì)胞化學(xué)法、熒光蛋白標(biāo)記分子法、熒光細(xì)胞染料標(biāo)記法等。與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比，除了有較高的分辨率以外，一個(gè)主要的不同是激光掃描共聚焦顯微鏡可以利用激光點(diǎn)掃描成像，形成所謂的“光學(xué)切片”，進(jìn)而可以利用沿縱軸上移動(dòng)標(biāo)本進(jìn)行多個(gè)光學(xué)切片的疊加形成組織或細(xì)胞中熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)的總體圖像，因此可以用于觀察切片和一些表面不平的標(biāo)本，特別是研究具有長(zhǎng)突起的神經(jīng)元時(shí)更有使用價(jià)值。同時(shí)可以做三維圖像重建和標(biāo)記強(qiáng)度的半定量分析。

2、定量或半定量測(cè)量Ca2+和pH等細(xì)胞內(nèi)離子濃度及變化

利用Fluo23 、Fura2等熒光探針可以測(cè)量Ca2+在活細(xì)胞內(nèi)的濃度及變化。一般來說，電生理記錄裝置加攝像技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)離子量變化的速度相對(duì)較快，但其圖像本身的價(jià)值較低，而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中鈣離子濃度動(dòng)態(tài)變化的圖像，這對(duì)于研究鈣等離子細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)有意義。最好與電生理等技術(shù)相結(jié)合來觀察離子變化與電生理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。

3、熒光光漂白及恢復(fù)技術(shù)

利用高能量激光束將細(xì)胞內(nèi)某一部分中選定靶區(qū)域的某種熒光淬滅，然后觀察鄰近相同的熒光標(biāo)記物重新擴(kuò)散入該區(qū)域的速度和方式，從而分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸、受體在細(xì)胞膜上的流動(dòng)和大分子組裝等細(xì)胞生物學(xué)過程。一般來說，需要用熒光蛋白等標(biāo)記物標(biāo)記需要研究的分子，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)后再做以上的實(shí)驗(yàn)。

4、長(zhǎng)時(shí)程觀察細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)

目前激光掃描共聚焦顯微鏡的軟件一般均可自動(dòng)控制地進(jìn)行定時(shí)和定方式的激光掃描，而且由于新一代激光掃描共聚焦顯微鏡的探測(cè)效率的提高，只需要很小的激光能量就可以達(dá)到較好的圖像質(zhì)量，從而減小了每次掃描時(shí)激光束對(duì)細(xì)胞的損傷，因此，可以用于數(shù)小時(shí)的長(zhǎng)時(shí)程定時(shí)掃描，記錄細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。

5、其他的生物學(xué)應(yīng)用

用高能量激光束進(jìn)行細(xì)胞損傷和損毀實(shí)驗(yàn)，一般要用紫外激光束進(jìn)行細(xì)胞損毀；細(xì)胞間通訊研究；光解籠鎖活化技術(shù)等。

三、激光共聚焦顯微鏡在以下研究領(lǐng)域中應(yīng)用較為廣泛

1、細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細(xì)胞凋亡；

2、生物化學(xué)：酶、核酸、FISH、受體分析；

3、藥理學(xué)：藥物對(duì)細(xì)胞的作用及其動(dòng)力學(xué)；

4、生理學(xué)：膜受體、離子通道、離子含量、分布、動(dòng)態(tài)；

5、遺傳學(xué)和組胚學(xué)：細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷；

6、神經(jīng)生物學(xué)：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運(yùn)輸和傳遞；

7、微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)：細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)；

8、病理學(xué)及病理學(xué)臨床應(yīng)用：活檢標(biāo)本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷；

9、生物學(xué)、免疫學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)。