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液相色譜“雙峰”的5大原因,輕松get!

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2023-11-20
核心提示:色譜雙峰指的是明明是同一種物質(zhì),但在色譜圖中卻呈現(xiàn)雙峰,讓實(shí)驗(yàn)人員誤認(rèn)為含有兩種物質(zhì)。那么,出現(xiàn)雙峰的原因主要有哪些呢?
色譜雙峰指的是明明是同一種物質(zhì),但在色譜圖中卻呈現(xiàn)雙峰,讓實(shí)驗(yàn)人員誤認(rèn)為含有兩種物質(zhì)。那么,出現(xiàn)雙峰的原因主要有哪些呢?今天小編就和大家聊一聊,液相色譜出現(xiàn)“雙峰”的原因。

在HPLC分析中,在色譜柱正常,樣品濃度適宜,分析方法合適,色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下,峰型應(yīng)對稱而尖銳。但在實(shí)際操作中,如果對樣品不了解,前處理不恰當(dāng)或者分析方法不合理等,會(huì)出現(xiàn)峰形不正常的情況,其中雙峰現(xiàn)象就是液相色譜中常見的問題之一。


出現(xiàn)色譜雙峰的原因一般有以下幾種原因:色譜柱的問題、溶劑、進(jìn)樣量、樣品特性,以及pH。

色譜柱


如果在樣品分析時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都有雙峰出現(xiàn),尤其在采用單一純物質(zhì)時(shí),則可以確定是色譜柱出現(xiàn)問題了,一般是柱頭受損或者柱頭固定相污染引起的。

如果進(jìn)樣量少,原來色譜柱正常,色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰,不一定拖尾,這一般應(yīng)是柱頭受堵,將色譜柱反過來接,用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑,將堵在柱頭的殘留物沖掉,再反過來,一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖,正沖有時(shí)也會(huì)正常的。
如果峰拖尾,雙峰強(qiáng)弱相差不大,柱頭固定相變臟或流失可能性更大,這時(shí)可以將進(jìn)樣頭擰開,將微孔濾片超聲,柱頭刮去一部分填料,重新填上新填料擰緊,不過這個(gè)對技術(shù)要求較高且不能經(jīng)常做,否則用不了幾次,色譜柱就會(huì)應(yīng)柱效降低而報(bào)廢。
如果上述不能解決問題,可能是柱塌陷造成的,此時(shí)需要更換色譜柱。


溶劑問題


目前HPLC分析多為反相色譜,流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水,加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解,最佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解。在實(shí)際分析中,有時(shí)候?yàn)榱藰悠返娜芙庑曰蚍(wěn)定性加入了一點(diǎn)的緩沖液,緩沖液的酸堿性可能會(huì)導(dǎo)致樣品轉(zhuǎn)化,從而產(chǎn)生雙峰現(xiàn)象。此時(shí)需要更換緩沖液,調(diào)整溶劑pH值,或者用流動(dòng)相配置樣品。

此外,樣品要現(xiàn)配現(xiàn)用,避免樣品溶解液的有機(jī)相比例、pH值發(fā)生變化而導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)。

進(jìn)樣量


當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑,如純甲醇、純乙腈,純乙醇,而分析體系中以水為主時(shí),如果樣品進(jìn)樣量大,如定量管為20ul,此時(shí)單一的純物質(zhì)會(huì)出現(xiàn)雙峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一樣),且拖尾,保留時(shí)間會(huì)提前(相對進(jìn)樣量少而言),將進(jìn)樣量減少一半以上,峰型將變?yōu)檎!_@是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大,而流動(dòng)相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的,此情況下需要減少進(jìn)樣量。

另一個(gè)原因是,進(jìn)樣量不一定大,但絕對量很大,色譜圖上的雙峰緊靠在一起,基本上齊高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色譜柱問題)。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了,這是由于進(jìn)樣量過大,色譜柱過載造成的。

樣品特性


有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),存在互變異構(gòu)現(xiàn)象,而這種互變異構(gòu)體無法分開,而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí),在一個(gè)特定的條件下(如pH值、流動(dòng)相極性、溫度等),一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰,雙峰靠的很近,基本齊高,不拖尾,條件稍一變化,尤其pH,雙峰現(xiàn)象將消失,如紅霉素等。

有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰,但在LC-MS下,用質(zhì)譜檢測器,其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯,如農(nóng)藥啶蟲瞇(吡蟲清)。

pH值


體系pH值對色譜雙峰的影響出現(xiàn)在各個(gè)環(huán)節(jié)上(前面已經(jīng)提到),尤其在緩沖液流動(dòng)相平衡過程中其影響更為明顯。當(dāng)連續(xù)進(jìn)樣時(shí),受pH的連續(xù)變化影響會(huì)經(jīng)常遇到這種雙峰的情況。另外,在樣品分析時(shí),流動(dòng)相的pH盡量遠(yuǎn)離被分析物的等電點(diǎn),否則也容易引起雙峰的產(chǎn)生。在用離子對試劑分析時(shí),選擇不好條件也會(huì)容易引起雙峰的產(chǎn)生。


HPLC分析中,在色譜柱正常,樣品靈敏度足夠,分析方法合適,色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下(不包括梯度),峰型應(yīng)對稱而尖銳。但是,在對樣品了解程度不夠,方法不妥,樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下,會(huì)出現(xiàn)各種意想不到的問題,而對色譜峰難以作出合理的解釋,尤其對于新手更是如此,所以,了解每種鬼峰出現(xiàn)的原因?qū)ξ覀兊姆治龉ぷ魇欠浅V匾摹?br />
文章來源:藥物分析化學(xué)社

文章(文字)來源:網(wǎng)絡(luò)

編輯:songjiajie2010

 
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