高效液相色譜法中的干擾峰是廣大色譜工作者甚為頭疼的事情,本文通過對(duì)干擾峰的來源進(jìn)行分類,對(duì)其產(chǎn)生原因進(jìn)行分析探究,簡(jiǎn)單歸納為3類:試劑/溶劑、器材以及液相系統(tǒng)。接下來對(duì)每一類干擾峰來源做簡(jiǎn)單的分析。
干擾峰的來源
一、試劑/溶劑
高效液相色譜法中,常用的試劑主要是有機(jī)溶劑、各種鹽類及水。有機(jī)溶劑一般多為購(gòu)買的色譜級(jí),所以出現(xiàn)問題的幾率較小。但是分裝出的有機(jī)溶劑,由于多次使用,被污染的概率較大,因此引入干擾峰的幾率較高。
其次是水,水中的雜質(zhì)是干擾峰的主要來源之一,這是大家極易忽視的問題。采集波長(zhǎng)較低的檢測(cè)方法,建議使用高品質(zhì)水,這樣可以避免很多因?yàn)樗|(zhì)帶來的問題。再次是各種鹽類,這也是色譜干擾峰的主要來源之一。如圖2所示,與圖1相比,如圖2加入磷酸二氫鉀后,16.5min處出現(xiàn)干擾峰。對(duì)于無機(jī)鹽引入的干擾峰,在方法開發(fā)初期一般就會(huì)給眼關(guān)注,尋找解決方案。方法確定后,鹽的品種及級(jí)別也同時(shí)確定,因此鹽對(duì)方法的影響基本可控。
水和無機(jī)鹽引起的干擾峰,比較快捷的解決方案是安裝鬼峰補(bǔ)集柱,這樣可以有效的避免此類干擾。如果使用離子對(duì)試劑,則需選擇不影響離子對(duì)試劑的鬼峰補(bǔ)集柱。
二、器材
干擾峰來源的第二個(gè)方面是流動(dòng)相配制及樣品前處理過程中接觸的各種器材。
首先是流動(dòng)相配制過程中接觸的器材,包括燒杯、玻璃棒、pH計(jì)、濾杯、濾膜、流動(dòng)相瓶等。燒杯、玻璃棒是配制流動(dòng)相首先接觸的器材,因此建議配制流動(dòng)相的燒杯、玻璃棒專用。濾杯實(shí)驗(yàn)人員只要清洗干凈一般不會(huì)帶來污染。需要注意的是,如果過濾含有離子對(duì)的流動(dòng)相,建議增加清洗次數(shù),避免清洗不干凈污染后續(xù)流動(dòng)相。因此,對(duì)濾杯的清洗應(yīng)該建立基本的洗滌規(guī)程,保證實(shí)驗(yàn)人員對(duì)使用的器材清洗到位。濾膜也是干擾峰引入源頭之一。
如圖3所示,乙腈經(jīng)過有機(jī)系濾膜過濾后,在梯度洗脫中會(huì)引入較大干擾峰。鑒于色譜級(jí)試劑廠家已經(jīng)過膜,且多數(shù)儀器都有脫氣機(jī),所以筆者建議無需再對(duì)甲醇、乙腈等純有機(jī)相過濾。流動(dòng)相瓶引入干擾峰的現(xiàn)象主要出現(xiàn)在夏季,這是由于夏季溫度高,純水相容易滋生細(xì)菌。后續(xù)的流動(dòng)相瓶使用人員清洗不到位,所以導(dǎo)致引入干擾峰。因此流動(dòng)相瓶的清洗要建立嚴(yán)格的洗滌規(guī)程。
再次樣品前處理過程中接觸的器材。前處理過程中接觸的器材主要包括容量瓶、濾頭、注射器及進(jìn)樣瓶。容量瓶的清洗同流動(dòng)相瓶、過濾裝置一樣,要建立良好的清洗規(guī)程。移液器材以及濾頭、注射器,多為塑料制品,其化學(xué)惰性較玻璃制品差,因此容易引入干擾峰。如下圖4、圖5、圖6所示案例,此方法檢測(cè)波長(zhǎng)為210納米,溶劑為正己烷-異丙醇(90:10),溶劑分別接觸移液槍槍頭、一次性吸管、一次性注射器后,均引入不同的干擾峰。
進(jìn)樣小瓶若為一次性使用,一般不會(huì)引入干擾峰。如果進(jìn)樣瓶反復(fù)清洗,多次使用,則應(yīng)建立清洗規(guī)程并對(duì)其清洗干凈程度進(jìn)行確認(rèn)。
三、液相系統(tǒng)
與前兩類干擾峰相比,液相系統(tǒng)干擾峰的解決更加困難。液相系統(tǒng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,所以此類問題解決過程耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),而且要求實(shí)驗(yàn)人員有很高的色譜素養(yǎng)。對(duì)此類問題來源主要?dú)w結(jié)為三類:強(qiáng)保留物質(zhì)、離子對(duì)污染和管路滋生細(xì)菌。
首先是強(qiáng)保留物質(zhì)的干擾,其主要特征是寬峰。此類問題多數(shù)發(fā)生在等度洗脫中,梯度洗脫主要出現(xiàn)在高比例有機(jī)相處。這是由于強(qiáng)保留物質(zhì)在當(dāng)次進(jìn)樣中未洗脫出,在后續(xù)進(jìn)樣洗脫出來所致。如圖7中9分鐘處的色譜峰。
對(duì)于此類干擾峰,可通過延長(zhǎng)采集時(shí)間或增加洗脫強(qiáng)度來消除對(duì)后續(xù)樣品的干擾。
系統(tǒng)干擾峰第二個(gè)方面是離子對(duì)、螯合劑這種難以洗脫的試劑對(duì)液相系統(tǒng)的污染。此類污染物多半是由于使用完畢含有離子對(duì)、螯合劑之類的流動(dòng)相后,對(duì)系統(tǒng)的沖洗不徹底所致。此類污染物主要對(duì)一些采集波長(zhǎng)較低的方法產(chǎn)生干擾,普遍表現(xiàn)是基線噪音大或者干擾峰,但隨著方法的運(yùn)行會(huì)逐漸趨于正常。
系統(tǒng)干擾峰第三個(gè)方面是系統(tǒng)滋生細(xì)菌。對(duì)于系統(tǒng)滋生細(xì)菌,多數(shù)讀者可能覺得不可思議,因?yàn)橐合嘞到y(tǒng)使用完畢都會(huì)用有機(jī)相沖洗保存。目前很多方法流動(dòng)相A都是水相,雖然水相每日都會(huì)新配制,但如果由濾頭到比例閥這一段管路長(zhǎng)時(shí)間在水相中就會(huì)滋生細(xì)菌。隨著時(shí)間的運(yùn)行,梯度洗脫中會(huì)逐漸的產(chǎn)生干擾峰。此類問題雖然比較隱蔽,但比較容易解決,只要每日對(duì)放置純水相的通道用有機(jī)相沖洗即可避免此類問題。
實(shí)際工作中,色譜工作者遇到的最大困難是如何識(shí)別判斷干擾峰屬于哪一類。由于找不清問題根源,所以也就難以有針對(duì)性的解決問題。
異常的色譜峰產(chǎn)生的原因
異常的色譜峰指的是色譜圖中的無峰或出現(xiàn)負(fù)峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對(duì)稱等情況。異常峰是色譜實(shí)驗(yàn)工作中最棘手的問題。這些峰嚴(yán)重影響色譜分析的結(jié)果。色譜圖中不可能有純正的高斯對(duì)稱峰 , 輕微的拖尾是正常的 , 這是由分離系統(tǒng)所決定的。在此僅對(duì)幾種異常峰進(jìn)行分析。
1、峰前或峰后有小峰的分析
產(chǎn)生原因大致分為以下幾種情形
(1) 樣品不純。可改變不同的流動(dòng)相和色譜柱 ,對(duì)樣品進(jìn)行分離比較 , 選擇合適的分離條件。
(2) 分析柱或保護(hù)柱柱頭塌陷。此情況較常見 ,可更換分析柱或保護(hù)柱后對(duì)峰形進(jìn)行比較。柱頭塌陷時(shí)往往所有的峰都會(huì)出現(xiàn)峰分裂 。對(duì)色譜柱再生和清洗可以改善分離效果。
(3) 色譜柱柱容量下降。當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間使用后 , 有一些強(qiáng)保留組分吸附在柱子中 , 不大的進(jìn)樣量往往就會(huì)出現(xiàn)峰分裂。用強(qiáng)洗脫能力的溶劑清洗色譜柱 , 或更換色譜柱可使問題得到改善。
(4) 樣品溶劑與流動(dòng)相不匹配或進(jìn)樣體積過大。當(dāng)樣品溶劑比流動(dòng)相極性大時(shí) , 有時(shí)即使進(jìn)樣體積很小 , 也容易出現(xiàn)峰變形和裂分現(xiàn)象。建議用流動(dòng)相溶解樣品。
(5) 流動(dòng)相不恰當(dāng)。此情況較罕見 , 有些樣品在特定的色譜條件下可能存在結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)平衡 , 而出雙峰 , 這種雙峰是無法分離完全的 , 改變色譜條件尤其是p H 值會(huì)使峰形正常。
(6) 樣品分解。不穩(wěn)定的樣品在色譜分離過程中變成其他物質(zhì)而出現(xiàn)雙峰。這時(shí)需改變樣品處理方法或色譜分離條件。
2、負(fù)峰分析
在色譜分析中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)負(fù)峰或倒峰 , 大峰的左下就有一負(fù)峰。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由以下幾種原因引起的 , 可針對(duì)不同情況進(jìn)行排除 , 進(jìn)而使問題得到解決。
(1) 流動(dòng)相吸收本底值過高。此時(shí)可適當(dāng)改變檢測(cè)波長(zhǎng)。
(2) 進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣。進(jìn)行排氣處理 , 直到基線平穩(wěn)再進(jìn)樣。
(3) 樣品組分的吸收低于流動(dòng)相?筛淖兞鲃(dòng)相或改變檢測(cè)波長(zhǎng)。
(4) 配制樣品的溶液與流動(dòng)相不一樣。重新配制樣品 , 用與流動(dòng)相一樣的溶劑配制或稀釋樣品。
3、前沿、拖尾峰分析
拖尾:1 干擾峰,優(yōu)化條件分離 ;2 色譜柱塌陷,更換色譜柱;3 流動(dòng)相pH不合適,調(diào)節(jié)pH值 ;4 管路沒有接好,存在較大的死體積,可以重新接一下。
前沿:1 溶劑選擇不合適,選擇合適的溶劑 ;2 樣品過載,降低進(jìn)樣量;3 柱溫太低,升高柱溫 ;4 色譜柱損壞,更換色譜柱 ;
圖譜前沿和拖尾的原因主要是流動(dòng)相選擇不合適,可以相應(yīng)調(diào)整流動(dòng)相的極性,或者適當(dāng)加入酸來調(diào)整,可以得到較好的改善。一般來講,酸堿在流動(dòng)相中對(duì)于前沿和拖尾影響較大。 柱前沿是可能因?yàn)橹d,拖尾是可能因?yàn)闃悠繁晃廴,選擇合適的流動(dòng)相,調(diào)節(jié)好PH能夠改善這以情況。
前輩們總是會(huì)告訴我們,拖尾峰與柱子有關(guān),可能是過載,稀釋樣品再做,或換新柱做。 有時(shí)候托尾峰往往是有機(jī)性相近雜質(zhì)沒有分開,此時(shí),可以優(yōu)化分析方法,或更換柱子試一試;也可能由于柱子使用時(shí)間太久柱效下降出現(xiàn)塌陷等原因;再有也會(huì)根樣品本身性質(zhì)有關(guān),基團(tuán)需要流動(dòng)相中添加能與之結(jié)合優(yōu)化峰形的化學(xué)物質(zhì),要根據(jù)具體情況而定。
4、色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理
液相上有一句經(jīng)典的話說得好 “出兩個(gè)峰肯定不是一種物質(zhì),出一個(gè)峰不一定是一種物質(zhì)”。
而色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì),但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰,而表明含二種物質(zhì)。我將這種情況分為四種原因。
(1)色譜柱
如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都雙峰出現(xiàn)(出峰越快,雙峰的可能性會(huì)減少),尤其采用單一純物質(zhì)時(shí),可以肯定色譜柱出問題-柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少,原來色譜柱正常,色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰,不一定拖尾,這一般應(yīng)是柱頭受堵,將色譜柱反過來接,用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑,將堵在柱頭的殘留物沖掉,再反過來,一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖,正沖有時(shí)也會(huì)正常的。如果峰拖尾,雙峰強(qiáng)弱相差不大,柱頭固定相變臟或流失可能性更大,高頻紅外碳硫分析儀這是可以將進(jìn)樣那頭擰開,將微孔濾片超聲,柱頭刮去一部分填料,重新填上新填料擰緊,不過這種活,需要一定技術(shù),同時(shí)不能老干那種事,否則用不了幾次,色譜柱就會(huì)應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。
(2)溶劑極性及進(jìn)樣量
許多HPLC分析者對(duì)此可能不以為然,一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會(huì)提到這方面的內(nèi)容,而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜,流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水,加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解,但是很多情況是不一致的。
當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑,如純甲醇、純乙腈,純乙醇,而分析體系中以水為主,樣品進(jìn)樣量大,如定量管為20ul,此條件下完全可以肯定,單一的純物質(zhì)出雙峰,第二峰比第一峰。看味疾惶粯樱,且拖尾,保留時(shí)間會(huì)提前(相對(duì)進(jìn)樣量少而言),將進(jìn)樣量減少一半以上,峰型將變?yōu)檎。這是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大,而流動(dòng)相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因,另一個(gè)原因是,進(jìn)樣量不一定大,但絕對(duì)量很大,色譜圖上的雙峰緊靠在一起,基本上齊高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色譜柱問題)。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了,這是由于進(jìn)樣量過大,色譜柱過載造成的。
(3)樣品的特性
有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),存在互變異構(gòu)現(xiàn)象,而這種互變異構(gòu)體無法分開,而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí),在一個(gè)特定的條件下,一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰,雙峰靠的很近,基本齊高,不拖尾,條件稍一變化,尤其pH,雙峰現(xiàn)象將消失,如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰,但在LC-MS下,用質(zhì)譜檢測(cè)器,其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯,例如我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇(吡蟲清)。
(4)參數(shù)
記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的,不必修改,但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的,例如C-R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時(shí)間間隔GC為2ms,HPLC 為5ms,如果記錄間隔時(shí)間縮短,一個(gè)峰將變?yōu)槎䝼(gè)峰或更多。
5、鬼峰、倒峰、未出峰
6、峰裂分
裂峰產(chǎn)生原因的確定
• 樣品基質(zhì)復(fù)雜或分析多種樣品——柱污染或部分阻塞濾片
• 流動(dòng)相 pH>=7——由于硅膠溶解導(dǎo)致柱塌陷(除非使用專門的柱子)
• 溶劑比流動(dòng)相的強(qiáng)度大——可能產(chǎn)生裂峰或?qū)挿澹蓸悠妨繘Q定 (溶劑化效應(yīng))
7、峰拖尾、峰展寬、峰前伸
峰拖尾原因的確定
• 評(píng)價(jià)柱選擇——使用高純度硅膠柱或不同鍵合技術(shù)柱
• 評(píng)價(jià)流動(dòng)相效果——改變流動(dòng)相pH和添加劑消除次級(jí)效應(yīng)(流動(dòng)相中組份與柱子相互作用)
• 減小進(jìn)樣量
• 消除柱外效應(yīng)
• 沖洗柱子——檢查柱子老化/塌陷
文章(文字)來源:實(shí)驗(yàn)室儀器分析。