色譜法總論

 

 

1.色譜分析法：

色譜法是一種分離分析方法，它利用樣品中各組分與流動(dòng)相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交換等性能上的差異)，先將它們分離，后按一定順序檢測各組分及其含量的方法。

 

2.色譜法的分離原理：

當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)，就會(huì)與柱中固定相發(fā)生作用(溶解、吸附等)，由于混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相發(fā)生作用的大小、強(qiáng)弱不同，在同一推動(dòng)力作用下，各組分在固定相中的滯留時(shí)間不同，從而使混合物中各組分按一定順序從柱中流出。這種利用各組分在兩相中性能上的差異，使混合物中各組分分離的技術(shù)，稱為色譜法。

 

3.流動(dòng)相——色譜分離過程中攜帶組分向前移動(dòng)的物質(zhì)。

 

4.固定相——色譜分離過程中不移動(dòng)的具有吸附活性的固體或是涂漬在載體表面的液體。

 

5.色譜法的特點(diǎn)：

(1)分離效率高，復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。

(2)靈敏度高，可以檢測出μg·g-1(10-6)級甚至ng·g-1(10-9)級的物質(zhì)量。

(3)分析速度快，一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。

(4)應(yīng)用范圍廣，氣相色譜：

沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。

液相色譜：

高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

(5)高選擇性:

對性質(zhì)極為相似的組分有很強(qiáng)的分離能力。

不足之處：

被分離組分的定性較為困難。

 

6.色譜分析法的分類：

按兩相狀態(tài)分類，按操作形式分類，按分離原理分類。

 

7.按兩相狀態(tài)分類：

氣相色譜(GasChromatography，GC)；

液相色譜(Liquid Chromatography，LC)；

超臨界流體色譜(Supercritical Fluid Chromatography，SFC)。

 

氣相色譜：

流動(dòng)相為氣體(稱為載氣)，常用的氣相色譜流動(dòng)相有N2、H2、He等氣體；

按分離柱不同可分為：

填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜；

按固定相的不同又分為：

氣固色譜和氣液色譜；

 

液相色譜：

流動(dòng)相為液體(也稱為淋洗液)；

按固定相的不同分為：

液固色譜和液液色譜；

 

超臨界流體色譜：

流動(dòng)相為超臨界流體，超臨界流體是一種介于氣體和液體之間的狀態(tài)。超臨界流體色譜法是集氣相色譜法和液相色譜法的優(yōu)勢而發(fā)展起來的一種新型的色譜分離分析技術(shù)，不僅能夠分析氣相色譜不宜分析的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性的試樣組分，而且具有比高效液相色譜更快的分析速率和更高的柱效率。

 

8.按操作形式分類：

柱色譜(Column Chromatography，CC):固定相裝在柱管內(nèi)，包括：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜。

紙色譜(Paper Chromatography, PC)固定相為濾紙；

采用適當(dāng)溶劑使樣品在濾紙上展開而進(jìn)行分離，薄層色譜(Thin Layer Chromatography, TLC)

固定相壓成或涂成薄層，操作方法同紙色譜。

 

9.按分離原理分類：

吸附色譜(Absorption chromatography)；

分配色譜(Partition Chromatography)；

離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography)；

凝膠色譜(Gel Chromatography)。

 

10.色譜圖：

組分在檢測器上產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度對時(shí)間(t)所作的圖，由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況，所以，又叫色譜流出曲線，流出曲線的突起部分稱為色譜峰。

 

11.色譜保留值：

色譜保留值是色譜定性分析的依據(jù)，它體現(xiàn)了各待測組分在色譜柱上的滯留情況。在固定相中溶解性能越好，或與固定相的吸附性能越強(qiáng)的組分，在柱中的滯留時(shí)間越長，或者說，將組分帶出色譜柱所需的流動(dòng)相體積越大，所以，保留值可以用保留時(shí)間和保留體積兩套參數(shù)來描述。

 

12.色譜圖上的色譜流出曲線可以說明什么問題：

根據(jù)色譜峰的數(shù)目，可判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)；根據(jù)色譜峰的保留值進(jìn)行定性分析;根據(jù)色譜峰的面積或峰高進(jìn)行定量分析；根據(jù)色譜峰的保留值和區(qū)域?qū)挾仍u價(jià)色譜柱的分離效能；根據(jù)兩峰間的距離，可評價(jià)固定相及流動(dòng)相選擇是否合適。

 

13.分配比：

分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比。

 

14.在色譜流出曲線上，兩峰之間的距離主要由兩組分在兩相間的分配系數(shù)還是擴(kuò)散速度決定?為什么?

答：分配系數(shù)。兩峰間的距離由熱力學(xué)因素決定，兩組分在兩相中分配系數(shù)差異越大，兩峰間的距離則相差越大，越容易被分離。而擴(kuò)散速度是動(dòng)力學(xué)因素，反映在色譜流出曲線上即為色譜峰的區(qū)域?qū)挾?形狀)。

 

15.色譜理論需要解決的問題：

色譜分離過程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。

 

16.組分保留時(shí)間為何不同?色譜峰為何變寬?

組分保留時(shí)間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制，(組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))。

色譜峰變寬：色譜過程的動(dòng)力學(xué)因素控制，(兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散作用)。

塔板理論和速率理論分別從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的角度闡述了色譜分離效能及其影響因素。

 

17.半經(jīng)驗(yàn)理論：

將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)(類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程)。

 

18.塔板理論的特點(diǎn)：

塔板理論引入了塔板數(shù)和塔板高度作為柱效的衡量指標(biāo)；不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測定物質(zhì)；柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時(shí)，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。

 

19.塔板理論的不足：

塔板理論的基本假設(shè)不符合色譜柱的實(shí)際分離過程。塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的流動(dòng)相流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不能說明色譜峰為什么會(huì)展寬，同時(shí)未能指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑和方法。

 

20.速率方程

(也稱范第姆特方程式)：

H=A+B/u+C·u，

H：塔板高度；

u：流動(dòng)相的平均線速度(cm/s)。

A.─渦流擴(kuò)散項(xiàng)：

A與流動(dòng)相性質(zhì)、流動(dòng)相速率無關(guān)。要減小A值，需要從提高固定相的顆粒細(xì)度和均勻性以及填充均勻性來解決。對于空心毛細(xì)管柱，A=0。固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑，表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。

 

B/u—分子擴(kuò)散項(xiàng)：

存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差；分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速↓，滯留時(shí)間↑，擴(kuò)散↑；

 

擴(kuò)散系數(shù)：

Dg∝(M載氣)-1/2；M載氣↑，B值↓。

C·u—傳質(zhì)阻力項(xiàng)：

dp↓，df↓，D ↑ ,可降低傳質(zhì)阻力。

 

21.H-u曲線與最佳流速：

由于，流速對這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值，即，速率方程式中塔板高度對流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應(yīng)流速u作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。

 

22.速率理論的要點(diǎn)：

組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展、柱效下降的主要原因；通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６�、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效；速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響；各種因素相互制約，如，載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響。選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。

 

23.色譜定性方法：

①與標(biāo)樣對照的方法：

利用保留值定性：

通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對比。

利用加入法定性：

將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。

②利用文獻(xiàn)保留值定性：

利用相對保留值r21定性。相對保留值r21僅與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊中都列有各種物質(zhì)在不同固定相上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進(jìn)行定性鑒定。

 

24.色譜定量分析：

①定量校正因子：

試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比，即，mi=fi’·Ai；

絕對校正因子：

比例系數(shù)fi；

單位面積對應(yīng)的物質(zhì)量：

fI ’=mi/Ai，相對校正因子fi：

即，組分的絕對校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對校正因子之比。

②常用的幾種定量方法：

（1）歸一化法：

特點(diǎn)及要求：

簡便、準(zhǔn)確；進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和操作條件的變動(dòng)對測定結(jié)果影響不大；僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。

（2）外標(biāo)法——標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

特點(diǎn)及要求：外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確性較高，操作條件變化對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。

對進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析。

(3)內(nèi)標(biāo)法：

內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：

(a)試樣中不含有該物質(zhì)；

(b)與被測組分性質(zhì)比較接近；

(c)不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；

(d)出峰位置應(yīng)位于被測組分附近，且能分離開；

(e)加入量適中并與待測組分接近。

內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn)：

內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高，操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動(dòng)對定量結(jié)果的影響不大；

每個(gè)試樣的分析，都要進(jìn)行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析；

若將內(nèi)標(biāo)法中的試樣取樣量和內(nèi)標(biāo)物加入量固定，則：wi=Ai/As*常數(shù)。

氣相色譜法

 

 

1.氣相色譜法(GC)：

是以氣體為流動(dòng)相的色譜分析法。

 

2.氣相色譜要求樣品：

氣化，不適用于大部分沸點(diǎn)高和熱不穩(wěn)定的化合物，對于腐蝕性能和反應(yīng)性能較強(qiáng)的物質(zhì)更難于分析。

大約有15%～20%的有機(jī)物能用氣相色譜法進(jìn)行分析。

 

3.氣相色譜儀的組成：

氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)。

 

4.氣路系統(tǒng)：

包括氣源、凈化器和載氣流速控制；

常用的載氣有：

氫氣、氮?dú)�、氦氣�?/span>

 

5.進(jìn)樣系統(tǒng)：

包括：

進(jìn)樣裝置和氣化室，氣體進(jìn)樣器(六通閥)：

試樣首先充滿定量管，切入后，載氣攜帶定量管中的試樣氣體進(jìn)入分離柱；

液體進(jìn)樣器：

不同規(guī)格的微量注射器，填充柱色譜常用10μL；毛細(xì)管色譜常用1μL；新型儀器帶有全自動(dòng)液體進(jìn)樣器，清洗、潤沖、取樣、進(jìn)樣、換樣等過程自動(dòng)完成，一次可放置數(shù)十個(gè)試樣。

 

6.進(jìn)樣方式：

分流進(jìn)樣：

樣品在汽化室內(nèi)氣化，蒸氣大部分經(jīng)分流管道放空，只有極小一部分被載氣導(dǎo)入色譜柱；

不分流進(jìn)樣：

樣品直接注入色譜的汽化室，經(jīng)過揮發(fā)后全部引入色譜柱。

 

7.分離系統(tǒng) ：

色譜柱：

填充柱(2～6mm直徑，1～5m長)，毛細(xì)管柱(0.1～0.5mm直徑,幾十米長)。

 

8.溫控系統(tǒng)的作用：

溫度是色譜分離條件的重要選擇參數(shù)；

氣化室、色譜柱恒溫箱、檢測器三部分在色譜儀操作時(shí)均需控制溫度；

氣化室：保證液體試樣瞬間氣化；

檢測器：保證被分離后的組分通過時(shí)不在此冷凝；

色譜柱恒溫箱：準(zhǔn)確控制分離需要的溫度。

 

9.檢測系統(tǒng)：

作用：將色譜分離后的各組分的量轉(zhuǎn)變成可測量的電信號(hào)；

指標(biāo)：靈敏度、線性范圍、響應(yīng)速度、結(jié)構(gòu)、通用性，通用型——對所有物質(zhì)均有響應(yīng)；專屬型——對特定物質(zhì)有高靈敏響應(yīng)；

檢測器類型：

濃度型檢測器：

熱導(dǎo)檢測器、電子捕獲檢測器；

質(zhì)量型檢測器：

氫火焰離子化檢測器、火焰光度檢測器。

 

10.熱導(dǎo)檢測器的主要特點(diǎn)：             

結(jié)構(gòu)簡單，穩(wěn)定性好；

對無機(jī)物和有機(jī)物都有響應(yīng)，不破壞樣品；

靈敏度不高。

 

11.氫火焰離子化檢測器的特點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：

(1)典型的質(zhì)量型檢測器；

(2)通用型檢測器(測含C有機(jī)物)；

(3)氫焰檢測器具有結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性好、靈敏度高、響應(yīng)迅速、死體積小、線性范圍寬等特點(diǎn)；

(4)比熱導(dǎo)檢測器的靈敏度高出近3個(gè)數(shù)量級，檢測下限可達(dá)10-12g·g-1；

缺點(diǎn)：

(1)對載氣要求高；

(2)檢測時(shí)要破壞樣品，無法回收樣品；

(3)不能檢測永久性氣體、水及四氯化碳等。。。

 

12.電子俘獲檢測器的特點(diǎn)：

對鹵素、硫、磷、氮、氧有很強(qiáng)的響應(yīng)；

靈敏度高，可用于痕量農(nóng)藥殘留物的分析；

線性范圍較窄。

 

13.火焰光度檢測器(FPD)：

是一種對含硫、磷化合物具有高選擇性的檢測器。含硫、磷化合物在富氫火焰中燃燒被打成有機(jī)碎片，發(fā)出不同波長的特征光譜。

 

14.固定相：

固體固定相：固體吸附劑；

液體固定相：由載體和固定液組成；聚合物固定相。

 

15.固體固定相：

一般為固體吸附劑，常用的有活性炭，硅膠，氧化鋁和分子篩。

優(yōu)點(diǎn)：

吸附容量大、熱穩(wěn)定性好、價(jià)格便宜；

缺點(diǎn)：

柱效低、吸附活性中心易中毒，使用前要進(jìn)行活化。

應(yīng)用：

主要用于惰性氣體、H2、O2、N2、CO、CO2和CH4等一般氣體和低沸點(diǎn)物質(zhì)。

 

16.作為載體使用的物質(zhì)應(yīng)滿足的條件：

表面有微孔結(jié)構(gòu)，孔徑均勻，比表面積大；

化學(xué)和物理惰性，即，與樣品組分不起化學(xué)反應(yīng)，無吸附作用或吸附很弱；

熱穩(wěn)定性好；

有一定的機(jī)械強(qiáng)度和浸潤性，不易破碎；

具有一定的粒度和規(guī)則的形狀，最好是球形。

 

17.對固定液的要求：

在使用溫度下是液體，具有較低的揮發(fā)性；具有良好的熱穩(wěn)定性；對要分離的各組分應(yīng)具有合適的分配系數(shù)；化學(xué)穩(wěn)定性好，不與樣品組分、載氣、載體發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)。

 

18.固定液的分類：

非極性固定液、中等極性固定液、強(qiáng)極性固定液、氫鍵型固定液。

 

19.非極性固定液：

主要是一些飽和烷烴和甲基硅油，它們與待測物質(zhì)分子之間的作用力以色散力為主。組分按沸點(diǎn)由低到高順序流出，若樣品中兼有極性和非極性組分，則同沸點(diǎn)的極性組分先出峰。

常用的固定液有角鯊?fù)?異三十烷)、阿皮松等。適用于非極性和弱極性化合物的分析。

 

20.中等極性固定液：

由較大的烷基和少量的極性基團(tuán)或可以誘導(dǎo)極化的基團(tuán)組成，它們與待測物質(zhì)分子間的作用力以色散力和誘導(dǎo)力為主，組分基本上按沸點(diǎn)順序出峰，同沸點(diǎn)的非極性組分先出峰。常用的固定液有鄰苯二甲酸二壬酯、聚酯等，適用于弱極性和中等極性化合物的分析。

 

21.強(qiáng)極性固定液：

含有較強(qiáng)的極性基團(tuán)，它們與待測物質(zhì)分子間作用力以靜電力和誘導(dǎo)力為主，組分按極性由小到大的順序出峰。常用的固定液有氧二丙腈等，適用于極性化合物的分析。

 

22.氫鍵型固定液：

是強(qiáng)極性固定液中特殊的一類，與待測物質(zhì)分子間作用力以氫鍵力為主，組分依形成氫鍵的難易程度出峰，不易形成氫鍵的組分先出峰。常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等，適用于分析含F(xiàn)、N、O等的化合物。

 

23.固定液的選擇：

①按極性相似原則選擇：

極性相似，溶解度大，分配系數(shù)大，保留時(shí)間長；

②按官能團(tuán)相似選擇：

酯類——酯或聚酯類固定液；

醇類——聚乙二醇固定液。

③按主要差別選擇：

各組分間沸點(diǎn)是主要差別——非極性固定液；極性為主要差別——極性固定液。

④選擇混合固定液：

對于難分離的復(fù)雜樣品，可選用兩種或兩種以上固定液。

 

24.聚合物固定相：

既可作為固體固定相，也可作為載體，又稱高分子多孔微球。物質(zhì)在其表面既存在吸附作用，又存在溶解作用。

(1)具有較大的比表面積，表面孔徑均勻；

(2)對非極性及極性物質(zhì)無有害的吸附活性，拖尾現(xiàn)象小，極性組分也能出對稱峰；

(3)由于不存在液膜，無流失現(xiàn)象，熱穩(wěn)定性好；

(4)機(jī)械強(qiáng)度和耐腐蝕性較好，系均勻球形，在填充柱色譜中均勻性、重現(xiàn)性好，有助于減少渦流擴(kuò)散。

 

25.載氣種類的選擇：

檢測器的適應(yīng)性，載氣流速的大小。

26.柱溫的選擇：

(1)首先應(yīng)使柱溫控制在固定液的最高使用溫度(超過該溫度固定液易流失)和最低使用溫度(低于此溫度固定液以固體形式存在)范圍之內(nèi)。

(2)提高柱溫，可以改善傳質(zhì)阻力，有利于提高柱效，縮短分析時(shí)間，但降低了容量因子和選擇性，不利于分離。一般的原則是：在使最難分離的組分盡可能分離的前提下，盡量采用較低的柱溫，但以保留時(shí)間適宜，峰形不拖尾為度。

(3)柱溫一般選擇在接近或略低于組分平均沸點(diǎn)時(shí)的溫度。

(4)組分復(fù)雜，沸程寬的試樣，采用程序升溫。

 

27.載體和固定液含量的選擇：

配比：

固定液在載體上的涂漬量，一般指的是固定液與擔(dān)體的百分比，填充柱的配比通常在5%～25%之間。

配比越低，擔(dān)體上形成的液膜越薄，傳質(zhì)阻力越小，柱效越高，分析速度也越快。配比較低時(shí)，固定相的負(fù)載量低，允許的進(jìn)樣量較小。分析工作中通常傾向于使用較低的配比。

 

28.進(jìn)樣條件的選擇：

進(jìn)樣量應(yīng)控制在柱容量允許范圍及檢測器線性檢測范圍之內(nèi)，進(jìn)樣要求動(dòng)作快、時(shí)間短，汽化室一般較柱溫高30~70°C。

 

29.提高色譜分離能力的途徑：

(1)塔板理論：

增加柱長，減小柱徑，即增加柱子塔板數(shù)；

(2)速率理論：

減小組分在柱中的渦流擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力，可降低塔板高度。

 

30.毛細(xì)管色譜柱的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：

(1) 不裝填料阻力小，長度可達(dá)百米的毛細(xì)管柱，管徑0.2mm；

(2)氣流單途徑通過柱子，消除了組分在柱中的渦流擴(kuò)散；

(3)固定液直接涂在管壁上，總柱內(nèi)壁面積較大,涂層很薄，則氣相和液相傳質(zhì)阻力大大降低。

(4)毛細(xì)管色譜柱柱效高達(dá)每米3000～4000塊理論塔板，一支長度100米的毛細(xì)管柱，總的理論塔板數(shù)可達(dá)104～106。

 

31.毛細(xì)管色譜具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)分離效率高：

比填充柱高10～100倍；

(2)分析速度快：

用毛細(xì)管色譜分析比用填充柱色譜速度；

(3)色譜峰窄、峰形對稱，較多采用程序升溫方式；

(4)靈敏度高，一般采用氫焰檢測器。

(5)渦流擴(kuò)散為零。

32.毛細(xì)管色譜的類型：

(1)涂壁毛細(xì)管柱：

將固定液直接涂敷在管內(nèi)壁上。柱制作相對簡單，但柱制備的重現(xiàn)性差、壽命短。

(2)多孔層毛細(xì)管柱：

在管壁上涂敷一層多孔性吸附劑固體微粒，構(gòu)成毛細(xì)管氣固色譜。

(3)載體涂漬毛細(xì)管柱：

將非常細(xì)的擔(dān)體微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效較涂壁毛細(xì)管柱高。

(4)化學(xué)鍵合或交聯(lián)毛細(xì)管柱：

將固定液通過化學(xué)反應(yīng)鍵合在管壁上或交聯(lián)在一起。使柱效和柱壽命進(jìn)一步提高。

高效液相色譜法

 

 

1.與氣相色譜相比液相色譜的優(yōu)點(diǎn)：

與氣相色譜法相比，液相色譜法不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性及相對分子質(zhì)量的限制，只要求把樣品制成溶液即可，非常適合于分離生物大分子、離子型化合物，不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物以及其他各種高分子化合物等。此外，液相色譜的流動(dòng)相不僅起到使樣品沿色譜柱移動(dòng)的作用，而且與固定相一樣，與樣品分子發(fā)生選擇性的相互作用，這就為控制和改善分離條件提供了一個(gè)額外的可變因素。而氣相色譜法采用的流動(dòng)相是惰性氣體，對組分沒有親和力，僅起運(yùn)載作用。

 

2.液相色譜特點(diǎn)：

高壓、高速、高效、高靈敏度、高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。

 

3.高效液相相色譜儀的組成：

高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

 

4.流動(dòng)相使用前必須脫氣：

常用的脫氣方法有：

低壓脫氣法(電磁攪拌、水泵抽空，可同時(shí)加熱或向溶劑吹氮?dú)?、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。

 

5.梯度洗脫：

用兩種(或多種)不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動(dòng)相中溶劑的配比和極性，通過流動(dòng)相中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。

 

6.高壓梯度(內(nèi)梯度)：

特點(diǎn)是先加壓后混合，將溶劑用高壓泵增壓以后輸入色譜系統(tǒng)的梯度混合室，加以混合后送入色譜柱。

低壓梯度(外梯度)：

特點(diǎn)是先混合后加壓。在常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)⑷軇┗旌虾笤儆帽幂斎肷�譜柱。

 

7.進(jìn)樣系統(tǒng)要求：

良好的密封性，最小的死體積，最好的穩(wěn)定性，進(jìn)樣時(shí)對色譜系統(tǒng)壓力、流量影響較小。

 

8.分離系統(tǒng)：

色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件。由柱管和固定相組成。柱管為直型不銹鋼管。一般色譜柱長5~30cm，內(nèi)徑4~5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3~12mm，而制備色譜柱內(nèi)徑則可達(dá)25mm。一般淋洗溶劑在進(jìn)入色譜分離柱之前，先通過前置柱。HPLC柱的填料顆粒粒徑一般約為3~10m，填充常采用勻漿法，色譜柱的發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

 

9.檢測系統(tǒng)：

作用——用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。紫外-可見吸收檢測器、光電二極管陣列檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器。

 

10.高效液相色譜法對流動(dòng)相的要求：

流動(dòng)相不與色譜柱發(fā)生不可逆化學(xué)變化，以保持柱效或柱子的保留性質(zhì)較長時(shí)間不變;對待測樣品有足夠的溶解能力；與所用檢測器相匹配；粘度盡可能小，以獲得較高的柱效；流動(dòng)相純度要高，價(jià)格便宜，毒性小。

 

11.高效液相色譜法的固定相的分類：

(1)按固定相承受壓力分：

剛性固體：

以二氧化硅為基質(zhì)，可承受較高壓力，表面可鍵合各種功能官能團(tuán)——鍵合固定相，是目前應(yīng)用最廣泛的固定相。

硬膠：

主要用于離子交換色譜法和凝膠色譜法中，由聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)而成，可承受的壓力較低。

(2)按孔隙深度分：

表面多孔型：

基體是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一層多孔活性物質(zhì)如硅膠、氧化鋁、聚酰胺、離子交換樹脂、分子篩等。

優(yōu)點(diǎn)：

適用于快速分離、填充均勻緊密、機(jī)械強(qiáng)度高、能承受高壓，適于簡單的樣品及常規(guī)分析；

缺點(diǎn)：

多孔層薄，進(jìn)樣量受限制；

全多孔型：

由硅膠顆粒聚集而成，比表面積大，柱容量大，小顆粒全孔型固定相孔洞淺傳質(zhì)速率快，柱效高，分離效果好，適合于復(fù)雜樣品、痕量組分的分離分析，是目前HPLC中應(yīng)用最廣泛的固定相。

 

12.液固吸附色譜法原理：

是以固體吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力，試樣分子被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)時(shí)，它將與流動(dòng)相溶劑分子在吸附劑表面發(fā)生競爭吸附。分離過程是一個(gè)吸附-解吸的平衡過程。

 

13.液固吸附色譜法固定相：

通常是硅膠、氧化鋁、活性炭等固體吸附劑，硅膠最常用；

流動(dòng)相：

極性大的試樣需用極性強(qiáng)的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。

應(yīng)用：

幾何異構(gòu)體分離和族分離，如農(nóng)藥異構(gòu)體；石油中烷、烯、芳烴的分離。不適于強(qiáng)極性的離子型樣品的分離，不適于分離同系物(因?yàn)�，它對相對分子質(zhì)量的選擇性較小)。

 

14.液液分配色譜法原理：

根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不同實(shí)現(xiàn)分離，分配系數(shù)較大的組分保留值也較大。

 

15.液液分配色譜法流動(dòng)相：

流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者二者的極性相差越大越好。根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜(流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于強(qiáng)極性和中等極性組分分離)和反相分配色譜(流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性或弱極性組分分離)。

固定相：

由載體和固定液組成。常用的固定液有b，b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鯊?fù)榈取?/span>

應(yīng)用：同系物組分的分離。

例：分離水解蛋白質(zhì)所生成的各種氨基酸，分離脂肪酸同系物等。

 

16.化學(xué)鍵合固定相：

化學(xué)鍵合固定相是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成各種性能的固定相。

 

17.化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)：

固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高；能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫；表面較為均一。沒有液坑，傳質(zhì)快，柱效高；能鍵合不同基團(tuán)以改變其選擇性。例如，鍵合氰基、氨基等極性集團(tuán)用于正相色譜法，鍵合離子交換基團(tuán)用于離子色譜法，鍵合C2、C4、C6、C8、C18、C16、C18、C22烷基和苯基等非極性基團(tuán)用于反相色譜法等。因此，它是HPLC較為理想的固定相。

 

18.離子交換色譜法原理：

離子交換色譜法的固定相是離子交換樹脂，流動(dòng)相是水溶液，它是利用待測樣品中各組分離子與離子交換樹脂的親和力的不同而進(jìn)行分離的。

 

19.離子交換色譜法流動(dòng)相：

水的緩沖溶液，陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

應(yīng)用：

離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。

 

20.凝膠色譜法原理：

凝膠色譜法的固定相為多孔性凝膠類物質(zhì)，流動(dòng)相為水溶液或有機(jī)溶劑，它是根據(jù)不同組分分子體積的大小進(jìn)行分離的。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100～105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。

 

21.凝膠色譜法流動(dòng)相：

能溶解樣品且與凝膠相似(潤濕凝膠并防止吸附作用)、粘度小(增加擴(kuò)散速度)。常用四氫呋喃、苯、氯仿、水等。

 

22.影響分離的因素與提高柱效的途徑:

(1)液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍左右，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。

(2)由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。

(3)液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。

(4)恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。

(5)流速大于0.5cm/s時(shí), H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。(6)氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。

 

 

質(zhì)譜分析法

 

 

1.質(zhì)譜法定義：

是將待測物質(zhì)置于離子源中電離形成帶電離子，讓離子加速并通過磁場或電場后，離子將按質(zhì)荷比(m/z)大小分離，形成質(zhì)譜圖。依據(jù)質(zhì)譜線的位置和質(zhì)譜線的相對強(qiáng)度建立的分析方法稱為質(zhì)譜法。

 

2.質(zhì)譜的作用：

準(zhǔn)確測定物質(zhì)的分子量；

質(zhì)譜法是唯一可以確定分子式的方法；

根據(jù)碎片特征進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)分析。

 

3.質(zhì)譜分析的基本原理：

質(zhì)譜法是利用電磁學(xué)原理，將待測樣品分子解離成具有不同質(zhì)量的離子，然后按其質(zhì)荷比(m/z)的大小依次排列收集成質(zhì)譜。根據(jù)質(zhì)譜中的分子離子峰(M+)可以獲得樣品分子的相對分子質(zhì)量信息；根據(jù)各離子峰(分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰等)及其相對強(qiáng)度和氮數(shù)規(guī)則，可以確定化合物的分子式;根據(jù)各離子峰及物質(zhì)化學(xué)鍵的斷裂規(guī)律可以進(jìn)行定性分析和結(jié)構(gòu)分析；根據(jù)組分質(zhì)譜峰的峰高與濃度間的線性關(guān)系可以進(jìn)行定量分析。

 

4.質(zhì)譜分析的過程：

（1）進(jìn)樣，化合物通過汽化引入電離室；

（2）離子化，在電離室，組分分子被一束加速電子碰撞，撞擊使分子電離形成正離子；

（3）離子也可因撞擊強(qiáng)烈而形成碎片離子；

（4）荷正電離子被加速電壓V加速，產(chǎn)生一定的速度v，與質(zhì)量、電荷及加速電壓有關(guān)；

（5）加速正離子進(jìn)入一個(gè)強(qiáng)度為B的磁場(質(zhì)量分析器)，發(fā)生偏轉(zhuǎn)。

 

5.質(zhì)譜儀的組成：

真空系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源或電離室、質(zhì)量分析器、離子檢測器。

 

6.真空系統(tǒng)作用：

是減少離子碰撞損失，若真空度低：大量氧會(huì)燒壞離子源的燈絲；會(huì)使本底增高，干擾質(zhì)譜圖；引起額外的離子-分子反應(yīng)，改變裂解模型，使質(zhì)譜解釋復(fù)雜化；干擾離子源中電子束的正常調(diào)節(jié)；用作加速離子的幾千伏高壓會(huì)引起放電等。

 

7.進(jìn)樣系統(tǒng)目的：

高效重復(fù)地將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低；間歇式進(jìn)樣系統(tǒng)——?dú)怏w及低沸點(diǎn)、易揮發(fā)的液體;直接探針進(jìn)樣——高沸點(diǎn)的液體、固體；色譜進(jìn)樣系統(tǒng)——有機(jī)化合物。

 

8.離子源或電離室：

作用是使試樣中的原子、分子電離成離子，其性能影響質(zhì)譜儀的靈敏度和分辨率本領(lǐng)。

電子電離源的特點(diǎn)：

電離電壓：

70eV；加一小磁場增加電離幾率；EI源電離效率高,碎片離子多，結(jié)構(gòu)信息豐富，有標(biāo)準(zhǔn)化合物質(zhì)譜庫；結(jié)構(gòu)簡單，操作方便；樣品在氣態(tài)下電離，不能汽化的樣品不能分析，主要用于氣-質(zhì)聯(lián)用儀；有些樣品得不到分子離子。

 

9.化學(xué)電離源特點(diǎn)：

電離能小，質(zhì)譜峰數(shù)少，譜圖簡單；最強(qiáng)峰為(M+1)+準(zhǔn)分子離子峰；不適用難揮發(fā)試樣。

 

10.快原子轟擊源：

高能量的Xe原子轟擊涂在靶上的樣品，濺射出離子流。本法適合于高極性、大分子量、低蒸汽壓、熱穩(wěn)定性差的樣品，F(xiàn)AB一般用作磁式質(zhì)譜的離子源。

 

11.電噴霧源結(jié)構(gòu)：

噴嘴(金屬毛細(xì)管)，霧化氣，干燥氣。

原理：

噴霧蒸發(fā)電壓。

特點(diǎn)：

ESI是最軟的一種電離方式，只產(chǎn)生分子離子，不產(chǎn)生碎片離子；適用于強(qiáng)極性，大分子量的樣品分析，如，肽，蛋白質(zhì)，糖等；產(chǎn)生的離子帶有多電荷，尤其是生物大分子；主要用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，既用作液相色譜和質(zhì)譜儀之間的接口裝置，同時(shí)又是電離裝置。

 

12.場致電離源(FI)和場解吸電離源(FD)：

分子離子峰強(qiáng)；碎片離子峰少；不適合化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

 

13.基質(zhì)輔助激光解吸電離特點(diǎn)：

準(zhǔn)分子離子峰很強(qiáng)且碎片離子少。通常用于飛行時(shí)間質(zhì)譜，特別適合測定多肽、蛋白質(zhì)、DNA片段、多糖等的相對分子質(zhì)量。

 

14.質(zhì)量分析器作用：

將離子源產(chǎn)生的離子按質(zhì)荷比m/z的大小分開。

 

15.單聚焦分析器：

離子的m/z與R，B，V有關(guān)。通過改變磁場可以把不同離子分開。在一定磁感應(yīng)強(qiáng)度B下，改變加速電壓V可以使不同離子先后通過檢測器，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量掃描，得到質(zhì)譜。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單，操作方便；只有方向聚焦，無能量聚焦，分辨率低。

 

16.雙聚焦分析器：

實(shí)現(xiàn)方向聚焦和能量(速度)聚焦；

對于動(dòng)能不同的離子，通過調(diào)節(jié)電場能，達(dá)到聚焦的目的。

特點(diǎn)：分辨率高。

 

17.四級桿質(zhì)量分析器：

特點(diǎn)：

結(jié)構(gòu)簡單，體積小、重量輕，掃描速率快，適合與色譜聯(lián)機(jī)。

 

18.飛行時(shí)間質(zhì)量分析器：

特點(diǎn)：質(zhì)量范圍寬，掃描速率快，既不需磁場也不需電場，只需要直線漂移空間。

 

19.離子阱質(zhì)量分析器：

特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢測器。

特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單、易于操作、靈敏度高。

 

20.質(zhì)譜的表示方法：

質(zhì)譜一般可用線譜或表譜兩種方法表示，常用線譜；線譜上的各條直線表示一個(gè)離子峰，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比m/z，縱坐標(biāo)為離子的相對強(qiáng)度(相對豐度)，一般將原始質(zhì)譜圖上最強(qiáng)的離子峰定為基峰并定為相對強(qiáng)度100%，其他離子峰以對基峰的相對百分值表示。能夠很直觀地觀察到整個(gè)分子的質(zhì)譜全貌；質(zhì)譜表是用表格形式表示的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，質(zhì)譜表中有兩項(xiàng)即質(zhì)荷比及相對強(qiáng)度，對定量計(jì)算較直觀。

 

21.質(zhì)譜儀的分辨率：

分辨率(R)指質(zhì)譜儀能區(qū)別鄰近兩個(gè)質(zhì)譜峰的能力，對兩個(gè)相等強(qiáng)度的相鄰峰，當(dāng)兩峰間的峰谷不大于其峰高10%時(shí)，則認(rèn)為兩峰已經(jīng)分開。

 

22.質(zhì)譜圖中主要離子峰的類型：

分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰。

 

23.相對分子質(zhì)量的測定：

分子離子峰的m/z相當(dāng)于該化合物的相對分子質(zhì)量。

一般除同位素離子峰外，分子離子峰是質(zhì)譜圖中最大質(zhì)荷比的峰，位于質(zhì)譜圖的最右端。

 

24.確認(rèn)分子離子峰的方法：

(1)分子離子峰必須符合氮數(shù)規(guī)則：

有機(jī)化合物含有偶數(shù)個(gè)氮原子或不含氮原子，分子離子峰的m/z一定是偶數(shù);含奇數(shù)個(gè)氮原子，分子離子峰的m/z一定是奇數(shù)；

(2)分子離子峰與相鄰離子峰的質(zhì)量差應(yīng)合理，如，不可能出現(xiàn)比分子離子峰質(zhì)量小4～13個(gè)質(zhì)量單位的峰；

(3)當(dāng)化合物中含S，Br，Cl時(shí)，可利用M+(M2+)+等同位素離子峰的比例來確認(rèn)分子離子峰。

(4)改變質(zhì)譜儀的操作條件，提高分子離子峰的相對強(qiáng)度。

※采用化學(xué)電離源或降低電子轟擊源電壓可獲得較強(qiáng)的M+峰。

 

25.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：

質(zhì)譜：

純物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。

色譜：

化合物分離，定性能力差。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：

共同優(yōu)點(diǎn)，GC-MS、LC-MS、CE-MS，色譜是質(zhì)譜的進(jìn)樣及分離系統(tǒng)，質(zhì)譜是色譜的檢測器。

主要問題：

接口技術(shù)，除去色譜中大量的流動(dòng)相分子。

適用范圍：

適用于揮發(fā)度低、難氣化、極性強(qiáng)、相對分子質(zhì)量大及熱穩(wěn)定性差的樣品。

 

26.無損檢測定義：

無損檢測技術(shù)即非破壞性檢測，就是在不破壞待測物質(zhì)原來的狀態(tài)、化學(xué)性質(zhì)等前提下，為獲取與待測物的品質(zhì)有關(guān)的內(nèi)容、性質(zhì)或成分等物理、化學(xué)情報(bào)所采用的檢查方法。

 

文章（文字）：化學(xué)分析計(jì)量