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液相使用常見問題15問答疑!

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2022-04-01
核心提示:1.用HPLC進(jìn)行分析時保留時間有時發(fā)生漂移,有時發(fā)生快速變化,原因何在?如何解決?關(guān)于漂移問題①溫度控制不好,解決方法是采用恒溫裝

1.用HPLC進(jìn)行分析時保留時間有時發(fā)生漂移,有時發(fā)生快速變化,原因何在?如何解決?

 

關(guān)于漂移問題

①溫度控制不好,解決方法是采用恒溫裝置,保持柱溫恒定

②流動相發(fā)生変化,解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等

③柱子未平衡好,需對柱子進(jìn)行更長時間的平衡

 

關(guān)于快速變化問題

①流速發(fā)生變化,解決辦法是重新設(shè)定流速,使之保持穩(wěn)定

②泵中有氣泡,可通過排氣等操作將氣泡趕出

③流動相不合適,解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合

 

2.為何會基線漂移

 

原因

①柱溫波動。(即使是很小的溫度變化都會引起基線波動。通常影響示差檢測器、電導(dǎo)檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器)

②流動相不均勻。(流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移)

③流通池被污染或有氣體

④檢測器出口阻塞。(高壓造成流通池窗口破裂,產(chǎn)生噪音基線)

⑤流動相配比不當(dāng)或流速變化

⑥柱平衡慢,特別是流動相發(fā)生變化時

⑦流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成

⑧樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)(高K值)以頭峰樣被洗脫出,從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線

⑨使用循環(huán)溶劑,不提倡。未調(diào)整檢測器

⑩檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處

 

解決方法

①控制好柱子和流動相的溫度,在檢測器之前使用熱交換器

②使用HPLC級的溶劑,高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進(jìn)行脫氣,使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣

③用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑中洗流通池。如有需要,可以用1N的的酸(不要用鹽酸)

④取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗

⑤更改配比或流速。為避兔這個問題可定期檢查流動相組成及流速

⑥用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗。更改流動相時,在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進(jìn)行沖洗。使用離子對試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱

⑦檢查流動相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑

⑧改變分析條件。使用保護(hù)柱,如有必要,在進(jìn)樣之間或在分析過程中,定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子

⑨重新設(shè)定基線。使用新的流動相

⑩將波長調(diào)整至最大吸收波長處。重選檢測波長

 

3.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

 

①樣品量不足,解決方法為増加樣品量

②樣品未從柱子中流出?筛鶕(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子

③樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢器

④檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可

⑤檢測器時間常數(shù)太大。解決辦法為降低時間參數(shù)

⑥檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗

⑦檢池中有氣泡。解決辦法為排氣

 

4. 如何進(jìn)行色譜柱的維護(hù)?

 

①建議檢測前樣品和流動相進(jìn)行過濾

②建議每天做完樣品后及時進(jìn)行清洗

③常規(guī)檢測:測試完后直接把色譜柱反向連接采用90%有機(jī)相沖洗45min,最后保存在純甲醇或純乙腈中

④使用緩沖鹽條件:

 

a.等度條件:使用緩沖鹽之前和之后都用過渡流動相以1ml/min流速沖洗45min

 

b.梯度條件:使用緩沖鹽之前與初始流動相組成相同的過渡流動相以1ml/min流速沖洗45min

 

注意:過渡流動相是指有機(jī)相和水相比例與分析流動相相同比例,只是不含有緩沖鹽


c.緩沖鹽沖洗干凈后,采用90%有機(jī)相反向沖洗60min,最后保存在純有機(jī)溶劑中

 

注意:如果使用緩沖液不能存留色譜柱中過夜

 

5.規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

 

原因

①在流動相、檢測器或泵中有空氣(尖銳峰)

②漏液

③流動相混合不完全

④溫度影響(柱溫過高,檢測器未加熱)

⑤在同一條線上有其他電子設(shè)備(偶然噪聲)

⑥泵振動

 

解決方法

①流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣

②檢查管路接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換泵密封

③用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑

④減少差異或加上熱交換器

⑤斷開LC、檢測器和記錄儀,檢查干擾是否來自于外部,加以更正。采用精密級穩(wěn)壓電源

⑥在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器

 

6.不規(guī)則的基線噪音是如何產(chǎn)生的

 

原因

①漏液

②流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成

③流動相各溶劑不相溶

④檢測器/記錄儀電子元件的問題

⑤系統(tǒng)內(nèi)有氣泡

⑥檢測器內(nèi)有氣泡

⑦流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音

⑧檢測器燈能量不足

⑨色譜柱填料流失或阻塞

⑩流動相混合不均勻或混合器工作不正常

 

解決方法

①檢查接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換密封。檢查流通池是否漏液

②檢査流動相的組成

③選擇互溶的流動相

④斷開檢測器和記錄儀的電源,檢查并更正

⑤用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng)

⑥清洗檢測器,在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器

⑦用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

⑧更換燈

⑨更換色譜柱

 

維修或更換混合器,在流動相不走梯度時,建議不使用泵的混合裝置

 

7.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時,很傷柱子,如使用一段時間后,柱效降低,峰形改變,如何恢復(fù)?


答:用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動相洗去多余氨),之后再進(jìn)行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1%

 

8.液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么?

 

①篩板堵塞或柱失效,解決辦法是反向沖洗柱子,替換篩板或更換柱子
②存在干擾峰,解決辦法為使用較長的柱子,改換流動相或更換選擇性好的柱子
③可能柱超載,減少進(jìn)樣量

 

 

9.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法是什么?

 

①樣品量不足,解決辦法為增加樣品量
②樣品未從柱子中流出,可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子
③樣品與檢測器不匹配,根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器
④檢測器衰減太多,調(diào)整衰減即可
⑤檢測器時間常數(shù)太大,解決辦法為降低時間參數(shù)
⑥檢測器池窗污染,解決辦法為清洗池窗
⑦檢測池中有氣泡,解決辦法為排氣
⑧記錄儀測壓范圍不當(dāng),調(diào)整電壓范圍即可
⑨流動相流量不合適,調(diào)整流速即可
⑩檢測器與記錄儀超出校正曲線,解決辦法為檢查記錄儀與檢測器,重作校正曲線

 

10.做HPLC分析時,柱壓不穩(wěn)定,原因何在?如何解決?

 

①泵內(nèi)有空氣,解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣,對溶劑進(jìn)行脫氣處理
②比例閥失效,更換比例閥即可
③泵密封墊損壞,更換密封墊即可
④溶劑中的氣泡,解決的辦法是對溶劑脫氣,必要時改變脫氣方法
⑤系統(tǒng)檢漏,找出漏點,密封即可
⑥梯度洗脫,這時壓力波動是正常的

 

11.HPLC柱驗收測試時柱壓過高,請問為什么?

 

柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的問題,您可按下面步驟檢查問題的起因:
①拆去保護(hù)預(yù)柱,看柱壓是否還高,否則是保護(hù)柱的問題,若柱壓仍高,再檢查
②把色譜柱從儀器上取下,看壓力是否下降,否則是管路堵塞,需清洗,若壓力下降,再檢查
③將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上,用10倍柱體積的流動相沖洗柱子,(此時不要連接檢測器,以防固體顆粒進(jìn)入流動池)。這時,如果柱壓仍不下降,再檢查。只用于使用過的柱子
④更換柱子入口篩板,若柱壓下降,說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì),正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高,請與廠商聯(lián)系。一般情況下,在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題

 

12.為何出現(xiàn)峰展寬?

①樣品體積過大:用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%
②在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展:進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散
③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢:設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點
④流動相粘度過高:增加柱溫,采用低粘度流動相
⑤檢測池體積過大:用小體積池,卸下熱交換器
⑥保留時間過長:等度洗脫時增加強(qiáng)溶劑含量,也可用梯度洗脫
⑦柱外體積過大:將連接管徑和連接管長度降至最小
⑧樣品過載:進(jìn)小濃度小體積樣品


13.流動相出現(xiàn)氣泡的原因有哪些?


①流動相溶液中往往因溶解有氧氣或空氣而形成氣泡
②液路阻力比較大,吸液時出現(xiàn)了真空氣泡
③系統(tǒng)開始工作時未能將流路中的空氣排除干凈
④在注入樣品時混入了空氣

 

14.常用的實驗室脫氣方式還有哪些?


①加熱回流脫氣,脫氣效果最佳,但無法保持

②氦脫氣,此方法脫氣效果佳,能除去百分之九十以上的空氣,但氦氣價格太貴,所以用的不多

③真空脫氣,效果僅次于氦脫氣,但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失

④超聲脫氣,只能脫去約百分之三十的空氣,但在實驗室中最常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣,方便且效果好


15.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時,很傷柱子,如使用一段時間后,柱效降低,峰形改變,如何恢復(fù)?


答:用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動相洗去多余氨),之后再進(jìn)行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1% 
編輯:songjiajie2010

 
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