一、 流動(dòng)相的要求
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,因此要求流動(dòng)相具備以下特點(diǎn):
1 純度 流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑,使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過(guò)濾)。溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累,會(huì)影響色譜柱的使用壽命。
2 溶解度 樣品的溶解度要適宜如果溶解度,如果溶解度欠佳樣品會(huì)在柱頭沉淀,不但影響純化分離,還會(huì)縮短柱子的使用壽命。
3 粘度要低(應(yīng)<2cp) 高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì),降低柱效,還會(huì)使柱壓降增加,使分離時(shí)間延長(zhǎng)。最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。
4 樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
5 流動(dòng)相 PH 采用反相色譜法分離弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品時(shí),通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值,以抑制樣品組分的解離,增加組分在固定相上的保留,并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸,流動(dòng)相的pH值越小,組分的k值越大,當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí),弱酸主要以分子形式存在;對(duì)弱堿,情況相反。分析弱酸樣品時(shí),通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸,常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液;分析弱堿樣品時(shí),通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿,常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
二、色譜泵的使用與維護(hù)
液相色譜泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng) 為了延長(zhǎng)泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性,必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操作:
1 防止任何固體微粒進(jìn)入泵體,因?yàn)閴m;蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥,因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾,而常用的方法是濾過(guò),可采用Millipore濾膜(0.2µm或0.45µm)等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。
2 泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完,否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、缸體或密封環(huán),最終產(chǎn)生漏液。
3 輸液泵的工作壓力決不要超過(guò)規(guī)定的最高壓力,否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形,產(chǎn)生漏液。
三、色譜柱的使用與維護(hù)
在日常分離分析工作中,色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要,色譜柱使用是否得當(dāng),直接影響色譜柱的壽命,在色譜操作過(guò)程中,需要注意下列問(wèn)題,以維護(hù)色譜柱。
1 柱子在裝卸、更換時(shí),動(dòng)作要輕,接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng),以免柱床產(chǎn)生空隙。
2 如果儀器用來(lái)做常規(guī)分析,樣品種類有限,但分析次數(shù)多,則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱,這樣有助于延長(zhǎng)柱子的壽命。
3 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩。
4 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?nbsp;
5 如使用柱溫控制裝置時(shí),應(yīng)注意在通人流動(dòng)相后才能升溫。
6 一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
7 選擇使用適宜的流動(dòng)相,以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預(yù)柱,分析柱是鍵合硅膠時(shí),預(yù)柱為硅膠,可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”,避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
8 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi),需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個(gè)保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
9 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí),對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡,每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,即常規(guī)分析需要50-75mL。
10 保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
11 色譜柱使用過(guò)程中,如果壓力升高,一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)人柱內(nèi),使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,死體積增大。
12 在完成分離分析工作之后,不應(yīng)立即停機(jī),需及時(shí)對(duì)色譜分析系統(tǒng)進(jìn)行沖洗,一般0.5h以上,以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。
12 在完成分離分析工作之后,不應(yīng)立即停機(jī),需及時(shí)對(duì)色譜分析系統(tǒng)進(jìn)行沖洗,一般0.5h以上,以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。