微生物實(shí)驗(yàn)步驟繁多,很容易出錯(cuò),奮斗在檢測(cè)一線的童鞋們,你遇到過實(shí)驗(yàn)空白板長菌的情況嗎?你又是怎么溯源的呢?是生理鹽水的問題,還是試管的問題,或是平皿的問題,或是環(huán)境的問題......到底該從哪里查起呢?別急,今天小編分享一篇菩提老師的佳作,我們一起來學(xué)習(xí)一下吧!
空白對(duì)照平板上又生長菌落,到底怎么溯源?
一、方法原理:
采用頭腦風(fēng)暴法(拍腦袋想,紙上談兵)和邏輯學(xué)方法進(jìn)行簡(jiǎn)單推理判斷。一邊找污染源,一邊在找的過程中消除掉一些污染源。在順序排除污染源時(shí),可以為下一步做鋪墊,消除掉一些絆腳的可能性,從而排除起來更順暢。查找其他步驟建立良好基礎(chǔ)也是為了最終目的服務(wù),最終目的就是消除所有潛在污染源。這里很佛系的講,找到或沒找到污染源頭都可以,不必太糾結(jié)。
二、建立假設(shè)(越詳細(xì)越好),還原“案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)”。
假設(shè)按照GB 4789.2-2022進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù),操作過程如下:
(一)、稱樣、均質(zhì),制備濃度0.1g/mL的樣品勻液B。
超凈臺(tái)通風(fēng),開著照明燈。點(diǎn)燃酒精燈,在火焰周圍稱樣:稱取樣品A25.0g,入到1L的均質(zhì)袋里,同時(shí)把滅菌好的225mL磷酸鹽緩沖溶液,也加入到1L的均質(zhì)袋里,總體積250mL,封口,計(jì)為樣品勻液B。
均質(zhì)袋拿出超凈臺(tái),放入桌面上的均質(zhì)器內(nèi),開啟均質(zhì)器拍打均質(zhì)袋1min。取出均質(zhì)袋,放入超凈臺(tái)內(nèi),放在均質(zhì)袋支架上。
(二)、10倍梯度稀釋法稀釋樣品和制備空白對(duì)照。
超凈臺(tái)通著風(fēng),酒精燈燃著,在火焰周圍開啟均質(zhì)袋口,用1mL移液器裝上吸頭盒里面的1mL規(guī)格的移液器吸頭,開始10倍梯度稀釋。
吸取1mL樣品勻液B(0.1g/mL),加入預(yù)先滅菌過的18mm×150mm試管中(裝有滅過菌的9mL磷酸鹽緩沖溶液),得到樣品勻液C(0.01g/mL)。
同理:吸取1mL樣品勻液C,加入預(yù)先滅菌過的18mm×150mm試管中(裝有滅過菌的9mL磷酸鹽緩沖溶液),得到樣品勻液D(0.001g/mL)。
...此為10倍梯度稀釋法原理,如果要稀釋n個(gè)10倍管(n≥3),按照同理往下即可。暫時(shí)認(rèn)為樣品勻液B、C、D濃度就夠用了。
(三)、傾注平板法制樣品皿和空白對(duì)照皿。
預(yù)先準(zhǔn)備8個(gè)滅過菌的空培養(yǎng)皿、1瓶200mL左右的熔化的PCA培養(yǎng)基保溫在水浴48℃中;靹驑悠穭蛞築、C、D。
分別取1mL樣品勻液B,加入到空白皿1、2,
分別取1mL樣品勻液C,加入到空白皿3、4,
分別取1mL樣品勻液D,加入到空白皿5、6,
分別取1mL磷酸鹽緩沖溶液,加入到空白皿7、8。
傾注PCA培養(yǎng)基至1~8皿,每皿20mL,冷卻、凝固。這樣,裝有樣品的皿分別是皿1、2、3、4、5、6,里面的濃度分別為0.1g/mL,0.01g/mL,0.001g/mL;皿7、8為空白對(duì)照皿。
(四)、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。
將皿1~8,倒置放入培養(yǎng)箱中,36℃培養(yǎng)48h。菌落計(jì)數(shù)。
(五)、發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照皿中有菌落污染。
假設(shè)發(fā)現(xiàn):1、很多菌,比如幾十個(gè)以上。
假設(shè)發(fā)現(xiàn):2、皿7菌落數(shù)0,皿8菌落數(shù)1。意思菌很少。
三、空白污染來源可能性的理論分析:
(一)、要進(jìn)行溯源性調(diào)查,要了解幾個(gè)概念和相互關(guān)系。
1.概念:充分條件,必要條件,充要條件。
2.相互關(guān)系:
假設(shè)A是條件,B是結(jié)論,設(shè)C、D分別為A、B所描述對(duì)象的集合,則有下列定義和推論:
(1)由A可以推出B,由B可以推出A,則A是B的充分必要條件(此時(shí)C等于D);
(2)由A可以推出B,由B不可以推出A,則A是B的充分不必要條件(此時(shí)C包含于D,且不相等);
(3)由A不可以推出B,由B可以推出A,則A是B的必要不充分條件(此時(shí)D包含于C,且不相等);
(4)由A不可以推出B,由B不可以推出A,則A是B的既不充分也不必要條件(此時(shí)C不包含D,D也不包含C)。
(二)、如果(一)中充分條件,必要條件,充要條件相互關(guān)系太抽象,想不明白的話,可以參考具體事例進(jìn)行理解。
例如:空白對(duì)照皿中污染(以后簡(jiǎn)稱:空白污染)和污染來源之間的關(guān)系。
判斷1:假如滅菌鍋滅菌不徹底,那么空白肯定污染(理論上)。
判斷2:假如移液器引入雜菌,那么空白肯定污染(理論上)。
理解1:觀察判斷1和判斷2,我們發(fā)現(xiàn),只要[滅菌鍋和(/或)移液器]引入污染,都會(huì)導(dǎo)致最終空白污染,所以(1)滅菌鍋滅菌不徹底是空白污染的充分條件之一。
理解2:空白污染,不能推出滅菌鍋滅菌不徹底。
因?yàn)榧僭O(shè)滅菌鍋滅菌徹底,其他環(huán)節(jié)污染,也能導(dǎo)致最終空白長菌。所以(1)滅菌鍋滅菌不徹底是空白污染的非必要條件。
理解3:綜合理解1和理解2,(1)滅菌鍋滅菌不徹底是空白污染的充分非必要條件。
(三)、弄清楚空白污染(結(jié)果)和各個(gè)環(huán)境引入雜菌(污染的可能性,條件)之間的關(guān)系,我們就可以進(jìn)行推斷,也就是溯源性調(diào)查。
還有一些隱藏的條件如:空白對(duì)照皿中污染的菌不是憑空產(chǎn)生的(因?yàn)槲⑸锊粫?huì)憑空出現(xiàn)),它只會(huì)從我們做實(shí)驗(yàn)的操作過程的某一個(gè)或多個(gè)甚至極端到全部環(huán)節(jié)引入。又因?yàn)榭瞻孜廴镜膩碓春芏,某一個(gè)污染都只是空白污染的充分非必要條件(一個(gè)源引入污染或多個(gè)源引入污染,都會(huì)導(dǎo)致最終現(xiàn)象-空白污染)。
我們只要把所有的污染來源都查到抓到一起,把所有的污染來源看成一個(gè)整體,那么這個(gè)整體和空白污染就構(gòu)成了充分必要條件。這其中存在沒有引入污染的,也藏著1個(gè)或多個(gè)污染來源。我們的目的就是抓到(如果可能)并消除污染來源,使以后不再發(fā)生。
(四)、(三)中提到“我們的目的就是抓到(如果可能)并消除污染來源,使以后不再發(fā)生!边@里對(duì)如果可能進(jìn)行解釋。
我們溯源調(diào)查采用的是通過假設(shè)、重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這樣的一個(gè)方法,這是有別于真實(shí)發(fā)生了污染的那次實(shí)驗(yàn),時(shí)間和條件都有變化,是一種情景還原模擬。
重復(fù)試驗(yàn)有時(shí)候能重復(fù)出來,比如設(shè)備某一個(gè)地方污染,再去檢測(cè)還能檢測(cè)到菌。
重復(fù)試驗(yàn)有時(shí)候不能重復(fù)出來,比如檢測(cè)員污染那次手上帶了菌,情景再現(xiàn)時(shí),消毒和操作都嚴(yán)格了,重復(fù)不出來了。所以針對(duì)這一現(xiàn)象我們要提醒做重復(fù)實(shí)驗(yàn)的人員,讓他盡量還原上一次的情況,不必太認(rèn)真也不必太放松,越接近上一次的情況模擬效果越好。
重復(fù)試驗(yàn)的可能出現(xiàn)和可能不出現(xiàn)的不確定性,讓我們要我們適當(dāng)進(jìn)行變通,由原來找到污染來源并消除,改成努力尋找污染來源,如果抓不到,退而求其次,只要能消除污染來源,通過后續(xù)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象不在出現(xiàn),也可以認(rèn)為達(dá)到了溯源調(diào)查的目的。
這個(gè)地方一定要想通,否則可能造成一種高尚的自虐行為。這一點(diǎn)要特別提醒檢測(cè)員,是因?yàn)槲覀兲厥獾穆殬I(yè)習(xí)慣(趨近完面和強(qiáng)迫癥),檢測(cè)人員越嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真,有時(shí)候容易鉆牛角尖,找不到污染來源時(shí),可能被嚴(yán)謹(jǐn)和認(rèn)真“反噬”,走火入魔,吃不好睡不好,整個(gè)人都不好了。
四、頭腦風(fēng)暴法列出可能的污染來源:
回看 “二、假設(shè)條件(越詳細(xì)越好)”寫各種設(shè)備及操作過程較為詳細(xì),這一點(diǎn)在溯源性調(diào)查中非常重要。我們要建立機(jī)制尋找較為全面的污染來源。
作為微生物單一菌體肉眼不可見的特點(diǎn),污染的來源藏在每一個(gè)細(xì)節(jié)里,所以進(jìn)行頭腦風(fēng)暴時(shí),一定要觀察入微,調(diào)查仔細(xì),不放過任何的可能性,簡(jiǎn)單的思想就是:懷疑一切。
如果想象力不很強(qiáng)大的人,平時(shí)可以多練習(xí)冥想,提高自己想象力。也可以通過回憶檢測(cè)過程、紙上談兵模擬推演檢測(cè)過程來幫助我們還原一個(gè)近似真實(shí)的“案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)”。
簡(jiǎn)單風(fēng)暴如下(因?yàn)槊總(gè)人的操作習(xí)慣及每一次偶然事件形成的特殊性,每個(gè)人要根據(jù)自己的情況進(jìn)行仔細(xì)進(jìn)行):我們按檢測(cè)過程進(jìn)行規(guī)律性的瞎猜。
1.滅菌鍋:
1.1、滅菌不徹底,滅完還有菌活的;
1.2、其他一切詭異的只有想不到?jīng)]有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
2.超凈臺(tái):
2.1超凈臺(tái)過濾效力下降,風(fēng)中帶菌。
2.2其他一切詭異的只有想不到?jīng)]有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
3.超凈臺(tái)內(nèi)部操作不當(dāng):
3.1沒開風(fēng)。
3.2風(fēng)力太小,亂流。
3.3超凈臺(tái)沒擦拭,環(huán)境惡劣。
3.4操作過程中離酒精燈遠(yuǎn)。
3.5操作過程移液器帶菌污染。
3.6操作過程中拿進(jìn)拿出樣品污染影響了環(huán)境造成污染。
3.7人帶進(jìn)去菌污染。
3.8其他一切詭異的只有想不到?jīng)]有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
4.培養(yǎng)箱內(nèi)造成的污染。
4.1風(fēng)太大,吹進(jìn)去。
4.2皿太濕,菌爬進(jìn)去。
4.3培養(yǎng)箱環(huán)境惡劣,只要進(jìn)去就有菌污染的小概率奇跡事件存在。
4.4其他一切詭異的只有想不到?jīng)]有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在。
5.其他:
5.1槍頭不新鮮。
5.2槍頭盒不新鮮。
5.3皿滅完濕漉漉的沒吹干,菌爬進(jìn)去了。
5.4其他一切詭異的只有想不到?jīng)]有做不到的奇跡一般的污染可能性的客觀存在
五、污染源調(diào)查要充分考慮順序性:
做事有序,處理事情就顯得簡(jiǎn)單,大腦處理起來也愉悅,同樣溯源性調(diào)查時(shí),充分利用分類學(xué),真相會(huì)相對(duì)容易發(fā)現(xiàn)。
所以枚舉時(shí),要充分考慮順序性。盡可能分塊進(jìn)行頭腦風(fēng)暴,一方面不容易漏掉,一方面也有利于我們回頭檢查自己是否漏掉了一些細(xì)節(jié)性的部分,化整為零,逐一擊破。相反,雜亂無章的亂想是不科學(xué)的,擾亂了自己的心緒,也容易漏掉一些可能性。
另外,順序條理的想問題,就把隨機(jī)性變成了一種特殊性,更好找規(guī)律。這在消除時(shí)也有幫助。
六、提出消除污染來源的試驗(yàn)方案:
經(jīng)過充分、有序的找到污染來源后。我們可以按從流程的源頭往后重新重復(fù)試驗(yàn)和排查。采用排除法。
我們做微生物實(shí)驗(yàn)最重要的概念之一“無菌概念”。也許無菌概念太抽象,那么我們反過來,提出“有菌概念”。意思整個(gè)環(huán)境都是有菌的,這就是有菌概念。那么要想獲取無菌的環(huán)境,只有在有菌的環(huán)境中撕開一個(gè)口子,制造無菌環(huán)境。
(一)首先,起點(diǎn)定在滅菌鍋這里(如果煮沸的培養(yǎng)基就不是這里了,沒說盡的事情自己靈活掌握),滅菌鍋是“潔凈之源”,重復(fù)滅菌看滅菌鍋滅菌充分不充分,由于滅菌后驗(yàn)證單獨(dú)不好執(zhí)行。就考慮和培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基聯(lián)系在一起進(jìn)行捆綁驗(yàn)證。意思就是沒有污染就都算合格,有污染再分別調(diào)查看是哪個(gè)污染。
同時(shí)重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)考慮培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基、移液器吸頭等是否有引入污染的可能性,都通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)和簡(jiǎn)單對(duì)比進(jìn)行。
具體操作:準(zhǔn)備100mL的三角瓶,每瓶配30mL的固體培養(yǎng)基,如此配10瓶,放在滅菌鍋的不同位置和層之間,按照之前的滅菌方式滅菌(不要過嚴(yán)也不要放松,目的是盡可能的還原污染時(shí)候滅菌的情況)進(jìn)行滅菌,滅菌后凝固了直接放培養(yǎng)箱里面36℃培養(yǎng)48h。
(二)滅菌鍋滅菌不徹底和培養(yǎng)箱的污染可能性的排查。
培養(yǎng)后觀察結(jié)果,再?zèng)]有看到皿時(shí),會(huì)有2種可能:沒長菌和長菌。
1.沒長菌。
認(rèn)為培養(yǎng)箱、滅菌鍋是沒有污染的,繼續(xù)下一步調(diào)查。如果對(duì)一次試驗(yàn)不放心,可以重復(fù)此實(shí)驗(yàn)3~5次,都沒有問題則認(rèn)為這步驟無污染。
2長菌。
認(rèn)為滅菌鍋、培養(yǎng)箱之間至少一個(gè)環(huán)節(jié)造成污染,為了區(qū)別是滅菌不充分還是培養(yǎng)過程進(jìn)去的,滅完菌后讓三角瓶適當(dāng)干燥后,直接室溫放置(培養(yǎng))48h,從而可以區(qū)分。另外需要注意的是,如果瓶子培養(yǎng)基菌很多,表面、內(nèi)部都有,那么可以認(rèn)為是滅菌不徹底,因?yàn)橐环矫姝h(huán)境空氣中要進(jìn)入三角瓶不容易(有封口膜封口),就算進(jìn)入數(shù)量也少,要進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)部可能性幾乎不可能,所以這時(shí)候重點(diǎn)就放在驗(yàn)證滅菌鍋滅菌效果上,比如使用生物指示劑驗(yàn)證。
(三)滅菌鍋已確認(rèn)污染來源情況并進(jìn)行了消除后,開展超凈臺(tái)內(nèi)污染可能性的排查。
針對(duì)“2.1超凈臺(tái)過濾效力下降,風(fēng)中帶菌”,做沉降菌試驗(yàn),看看吹出來的風(fēng)是不是有污染。這時(shí)候順序排查的優(yōu)勢(shì)就出來了,只有鍋好的,培養(yǎng)基滅完是無菌的,沉降菌出現(xiàn)菌才能說明排風(fēng)有問題,當(dāng)然同時(shí)要注意排除人的污染性。
做沉降之前,超凈臺(tái)可以進(jìn)行一次擦拭和清潔,這樣如果沒有污染了也好,因?yàn)槲覀冋业交蛘也坏轿廴驹炊疾灰o,重要的是以后不再出現(xiàn)這個(gè)污染的現(xiàn)象。
針對(duì)“超凈臺(tái)內(nèi)部操作不當(dāng)”的原因,要考慮人為原因,要建立無菌概念,以及可以幾個(gè)人一起操作或進(jìn)行外部培訓(xùn)等,消除個(gè)人操作的一些陋習(xí)。從而達(dá)到反復(fù)實(shí)驗(yàn)也不污染,才能上崗,總之微生物基礎(chǔ)還需要加強(qiáng)。
超凈臺(tái)沒問題了,就去考慮培養(yǎng)箱的問題。
七、總結(jié)一下污染物溯源調(diào)查的思路:
污染物溯源調(diào)查沒有定法,腦子要活絡(luò),一方面要非常熟悉檢測(cè)流程和建立關(guān)鍵控制點(diǎn),同時(shí)要充分考慮被污染的每一個(gè)環(huán)節(jié),前后推敲,找出盡可能多的污染來源。在設(shè)想污染可能性的起始階段,要放下“我沒有做錯(cuò),我沒污染”的思想包袱,要懷疑一切,假設(shè)每個(gè)細(xì)節(jié)都有污染,我們通過試驗(yàn)去證明是否有污染,因?yàn)閷?shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn),真理沒有經(jīng)過實(shí)踐驗(yàn)證,都可能是謬誤。這是建立在我們唯物主義價(jià)值觀以及認(rèn)為世界是客觀存在、以及客觀存在是正確的統(tǒng)一認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上的(這個(gè)認(rèn)識(shí)從牛頓時(shí)代才建立的)。
理出一個(gè)排除的思路,盡量按照順序、分塊、化整為零的方式進(jìn)行,充分考慮各種可能性之間的如關(guān)聯(lián)、排他等內(nèi)在邏輯關(guān)系。排除過程中嚴(yán)謹(jǐn)推斷,不能遺漏。
同時(shí)還要考慮主觀能動(dòng)性,有些地方單一搞不了,那就分分合合,怎么方便怎么能達(dá)到最終消除污染就行。
這樣一步一步走下去,最終找到真相,從而消除空白污染。