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質(zhì)粒載體和外源DNA中限制酶切位點的性質(zhì)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-04-26

 

  如今,質(zhì)粒載體中限制酶切位點的種類極為繁多,因而通常都有可能找到某種帶限制酶切位點恰恰與外源DNA片段本身毫無二致的載體。這就具備一個不可比擬的優(yōu)點,也應(yīng)是可以用相應(yīng)的限制酶消化重組質(zhì)粒崦回收外源DNA。另一種方案,則是把片段插入到載體中能產(chǎn)生匹配末端的任何位點中。例如,識別不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ產(chǎn)生具有相同突出末端的限制酶切片段,這樣用BglⅡ消化而制備的外源DNA片段可以克隆到用BanHl消化的質(zhì)粒中。這通常會使接合序列不能被曾用于外源DNA或制備載體的任何一種酶所切開。然而很多清況下,用切點位于多克隆序列側(cè)翼的限制酶進(jìn)行消化,可將片段從重組質(zhì)粒中摘出。偶爾在質(zhì)粒的以及外源DNA兩端的限制酶切位點之間,不可能找到“門當(dāng)戶對”的搭配關(guān)系。這時可用下面兩種方案加以解決:
1)在線狀質(zhì)粒末端和(或)外源DNA片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。
2)在得到控制的反應(yīng)條件下,用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段部分補平帶3'凹端的DNA片段。如第九章所討論,這樣?梢允鼓切┎幌嗥ヅ涞南拗泼盖形稽c轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa末端,從而促進(jìn)載體和外源DNA的連接。因為部分補平反應(yīng)消除了同一分子兩端彼此配對的能力,故連接反應(yīng)過程中環(huán)化和自身寡聚化的機會也會有所降低(Hung和Wensink,1984;Zabarovsky和Allikmets,1986)。

 
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