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經(jīng)乙二醛和二甲基亞砜變性處理后進(jìn)行的RNA電泳

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-04-26

 

  這一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛-DMSO的凝膠比含有甲醛的凝膠更難于進(jìn)行電泳, 因?yàn)榍罢哂緞?dòng)速率較慢而且需將電泳液時(shí)行循環(huán)以避免電泳過(guò)程中形成過(guò)高的H+梯度。盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率(Miller,1987),但用含朋乙二醛-DMSO的凝膠對(duì)RNA進(jìn)行分級(jí)離,通常Northern雜交所顯示的RNA條帶更為銳利。
1)在滅菌的微理離心管內(nèi),混勻下列液體:
6mol/L乙二醛 5.4μl
DMSO 16.0μl
0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μl
RNA(多達(dá)10μl) 5.4μl市售乙二醛通常為40%溶液(6mol/L)。 由于接觸空氣的后乙二醛易于氧化,所以使用前需通過(guò)混合床樹(shù)脂(Bio-Rad AG 501-X8 對(duì)乙三醛溶液進(jìn)行去離子處理,直至溶液pH值大于5.0為止,然后可分裝在小份, 用蓋緊的小管貯存于-20℃。每小份乙二醛溶液只用1次,剩余液體應(yīng)予丟棄。0.1mol/L磷酸鈉(pH7. 0)的配法如下:將3.9ml 1mol/L磷酸二氫鈉、6.1ml 1mol/L磷酸氫二鈉和90ml 水混合,用DEPC處理上述溶液后高壓滅菌。每一泳道至多可分析10μg RNA,通常用10- 20 μg 細(xì)胞總RNA進(jìn)行Northern雜交,可以檢測(cè)高豐度mRNA(占mRNA總量的0.1%以上),如等測(cè)RNA含量極微,每個(gè)泳道應(yīng)加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。
2)將微量離心管蓋嚴(yán),將RNA溶液置于%0℃溫育50℃溫育60分鐘后, 用冰水浴冷卻樣品,離心5秒鐘,使管內(nèi)所有液體沉降至管底。
3)于50℃溫育RNA溶液的同時(shí),灌制瓊脂糖水平凝膠,用1.4 %瓊脂糖分析1kb 以下的RNA樣品, 而用1%瓊脂糖分析1kb 以上的RNA樣品。 用0mmol/L 磷酸鈉(pH7. 0 )后, 降溫至70 ℃, 加入碘乙酸鈉固體至終濃度為10mmol/L(使RNA酶失活),再降溫至50℃,制膠,加入RNA樣品前一至少放置30分鐘使其凝固。用于RNA電泳的電泳槽需用去污劑溶液洗凈,用水沖洗,用乙醇干燥,然后灌滿3%H2O2,于室溫放置10分鐘后,用經(jīng)DEPC處理的水徹底沖洗電泳槽。因乙二醛可與溴化乙錠發(fā)生化學(xué)反應(yīng),所以制膠和電泳過(guò)程中誚避免作用溴化乙錠。
4)將RNA樣品冷卻至0℃,加入4μl 滅菌的并經(jīng)用DEPC處理的戊二醛-DMSO凝膠中樣緩沖液,隨后立即將上述樣品加至凝膠加樣孔。用已知大小的乙醛酰RNA作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物,如用18S和28S rRNA或或9S兔β-珠蛋白mRNA,上述RNA長(zhǎng)度分別為6322、2366和710個(gè)堿基。也可以從BRL購(gòu)置已知大小的RNA混合物作為分子量標(biāo)準(zhǔn)照物。通常分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的泳道位于凝膠邊緣,便于電泳后將其切去進(jìn)行溴化乙錠染色,可能的話應(yīng)在分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物以及欲轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜的樣品之間留空一個(gè)泳道。
乙二醛-DMSO凝膠加樣緩沖液
50%甘油
10mmol/L磷酸鈉(pH7.0)
0.25%溴酚藍(lán)
0.25%二甲苯青FF
5)將凝膠浸入10mmol/L磷酸鈉電泳液中,以3-4V/cm電壓降進(jìn)行電泳,同時(shí)按圖7.1對(duì)磷酸鈉容液時(shí)行持續(xù)再循環(huán),使溶液pH值維持在可被接受的限度 內(nèi)(pH>8.0時(shí)乙二醛將從PNA分子上解離)。另一方法為電泳時(shí)每30分鐘換一次磷酸鈉緩沖液。
6)電泳結(jié)束后(溴酚藍(lán)遷移出區(qū)8cm),切下分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的凝膠條,浸入溴化憶錠溶液(0.5μg/ml,
用0.1mol/L乙酸銨配制)中染色30-45分鐘。在凝膠放置一透明遲,在紫外燈下照片上每個(gè)RNA條帶至加樣孔的距離,以RPN片段大小的lg對(duì)數(shù)值對(duì)RNA條帶的遷移距離作圖,用所得曲線計(jì)算從凝膠移到固相支持體后通過(guò)雜交檢出的RNA分子的大小。
7)RNA從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜,將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜。

 
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