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外源DNA片段未的性質(zhì)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-04-26

 


1.帶有非互補(bǔ)突出端的片段

  用兩種不同的限制酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端的片段,刀就是最容蜴 克隆的片段。常用的大多數(shù)質(zhì)粒載體均帶有由幾個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)。由于現(xiàn)有的多克隆位點(diǎn)如此多樣,因而幾乎總是能找到一種帶有與外DNA片段未匹配的限制切位點(diǎn)的載體。于是,采用所謂的定向克隆即可將外源DNA片段插入到載體當(dāng)中。例如:載體pUC19用BamHl和Hind-Ⅲ進(jìn)行消化,然后,通過(guò)凝膠電泳或大小排阻凝膠層析純化載體大片段,以使同芤下來(lái)的多克隆位點(diǎn) 缺小片段分開(kāi)。于是,這一載體就可以同有與BamHl和HindⅢ所切出未端相匹配的粘端的外源DNA區(qū)段相連接。用得到的環(huán)狀重級(jí)體化大腸桿菌,檢查氨芐青霉素抗性。由于HindⅢ和BomHI的突出端不互補(bǔ),載體片段不能有效地環(huán)化,所以轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率也極低。因此,大多數(shù)具有氨芐表霉素抗性的細(xì)菌都含有帶外源DNA區(qū)段的質(zhì)業(yè),外源DNA區(qū)段成為連接HindⅢ和BamHI位點(diǎn)的橋梁。當(dāng)然,可以根據(jù)特定的外源DNA區(qū)段來(lái)改變限制酶的組合方式。   如要制備定向克隆載體,它盡量避免使用大多克隆位點(diǎn)上彼此直接相鄰的限制酶切位點(diǎn)。這些位點(diǎn)中的一個(gè)被切開(kāi)以后,第二個(gè)位點(diǎn)應(yīng)位于線狀DNA分子一端的幾個(gè)堿基對(duì)之內(nèi),這樣過(guò)于靠近末端,不利于多種限制酶的有效切割。正因?yàn)槿绱,所以?wù)必檢查兩種限制酶對(duì)載體的消化是否完全?刹捎靡韵聝煞N檢查方法: 1)用兩種限制酶中的一種對(duì)載體進(jìn)行消化,當(dāng)所用限制酶的最撻緩沖液對(duì)離子強(qiáng)度的要求有不同時(shí),應(yīng)使用所要求的鹽濃度較低的酶。消化完后,應(yīng)通過(guò)凝膠電泳對(duì)一小份DNA進(jìn)行檢查。如所有質(zhì)粒DNA均從環(huán)狀轉(zhuǎn)變?yōu)榫狀分子時(shí),適當(dāng)調(diào)整鹽濃度,并加入第二種酶。同時(shí),另行設(shè)立一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn),其中含有環(huán)狀質(zhì)粒DNA,并只加兩種限制酶中的第二種。當(dāng)預(yù)實(shí)驗(yàn)中的所有DNA都轉(zhuǎn)變?yōu)榫狀(由凝膠電泳確定)時(shí),通過(guò)凝膠電泳或尺墳排阻凝膠層析純化質(zhì)粒DNA大片段。\par 2)圖1.7所示的是檢查消化反應(yīng)完全程度的一種更為嚴(yán)格的方法。對(duì)用第一個(gè)限制酶切割的一小份DNA進(jìn)行末端標(biāo)記,經(jīng)離盡柱層析法純化后,與未標(biāo)記的線狀DNA混合。然后用第二個(gè)酶消化,完全消化可使DNA小片段釋放,它應(yīng)帶有50%的放射性活度,這可通過(guò)層析或通過(guò)凝膠電泳和放射自顯影加以檢測(cè)。

2。帶有相同末端(平端或粘端)的片段

  帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線狀質(zhì)粒載體中。在連接反應(yīng)中,外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此,必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩個(gè)DNA的濃度,以便使“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最佳水平(見(jiàn)本節(jié)三).此外,常常使用堿性磷酸酶去除5'磷酸基團(tuán)以抑制質(zhì)粒DNA的自身連接和環(huán)化。在體外連接反應(yīng)中,僅當(dāng)一個(gè)核苷酸含5'磷酸基團(tuán)而另一個(gè)含3'羥基時(shí),T4噬菌體DNA連接酶可催化相鄰核苷間形成磷酸二酯健。用細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)或牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去除線狀DNA兩端的5'磷酸可以最大限度的地減少質(zhì)粒DNA區(qū)段可有效地與去磷酸化質(zhì)粒DNA相連接,產(chǎn)生一個(gè)含有兩個(gè)切口的開(kāi)環(huán)分子(圖1.8)。因?yàn)榄h(huán)狀DNA(即使是帶切口的環(huán)狀DNA)的轉(zhuǎn)化效率比線狀DNA高得多,所以大多數(shù)轉(zhuǎn)化體都含有重組質(zhì)粒。

3.帶有平端的片段

  外源DNA片段帶平端時(shí),還有一樁切外生枝的麻煩事,這就是蛺端的連接效率比起帶有突出互襪末端的DNA要低得多。因此,涉及平端分子的連接反應(yīng)所要求的T4噬菌體DNA連接酶的濃度和外源及質(zhì)粒DNA的濃度都要高得多。還要說(shuō)明的是,加入低濃度的如聚乙二醇一類的物質(zhì),?商岣哌@類反應(yīng)的效率。

 
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