亚洲成aⅴ人在线观看_亚洲欧美日韩综合一区在线观看_国产无码电影一区二区三区_国语精品91自产拍在线观看二区

VIP標(biāo)識(shí) 上網(wǎng)做生意,首選VIP會(huì)員| 設(shè)為首頁(yè)| 加入桌面| | 手機(jī)版| RSS訂閱
食品伙伴網(wǎng)服務(wù)號(hào)
 

DNA化學(xué)合成的應(yīng)用

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-04-26

 

隨著DNA合成技術(shù)的發(fā)展,特別是自動(dòng)化合成技術(shù)的引入,人們能簡(jiǎn)便、快速、高效地合成其感興趣的DNA片段。目前,DNA合成技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究必不可少的手段,并且已在基因工程、臨床診斷和治療、法醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域中日益發(fā)揮重要的作用。

1. DNA合成在基因工程和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用

1.1合成基因
  目前有許多基因和蛋白質(zhì)的核苷酸和氨基酸序列已得到闡明,人們已經(jīng)可以根據(jù)需要合成出具有實(shí)際應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值的多肽和蛋白質(zhì)基因。已報(bào)道的合成基因有人生長(zhǎng)激素、干擾素、胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素II、集落刺激因子等,這些基因均已被克隆,絕大多數(shù)已在原核和真核系統(tǒng)中獲得表達(dá)。我國(guó)上海生物化學(xué)研究所等單位于19841年首次在世界上合成了具有生物學(xué)活性的酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸,為人類(lèi)文明作出了應(yīng)用的貢獻(xiàn)。
  目前,合成基因的方式有2種。①全基因合成:一般對(duì)于分子較小而又不易得到的基因采用該方式?蓪㈦p鏈基因分成若干寡核苷酸單鏈片段(尤其待合成基在在100個(gè)核苷酸以上時(shí)),每個(gè)片段長(zhǎng)度控制在40~60個(gè)堿基,并使每對(duì)相鄰互補(bǔ)的片段之間有~6個(gè)堿基交叉重疊。在體外將除基因兩端末端外的所有片段磷酸化。混合退火后加入DNA連接酶,即可得到較大的基因片段。如果需連接亞克隆的方法,最后將亞克隆的較大片段重組為完整的基因。采用分步連接、亞克隆的方法時(shí),為便于亞克隆中回收基因片段。應(yīng)在片段兩側(cè)設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn),由于每個(gè)亞克隆可以分別鑒定,從而可減少順序錯(cuò)誤的可能性。②酶促合成:此法又稱(chēng)基因的半合成。全基因,特別是較大的基因的全部化學(xué)合成成本昂貴,使用半合成的方法可以降低成本,從而利于普及使用。首先合成末端之間有10~14個(gè)互補(bǔ)堿基的寡核苷酸片段,退火后以重疊區(qū)作為引物,在4種dNTP存在的條件下,通過(guò)DNA聚合酶I大片段(Klenow酶)或反轉(zhuǎn)錄酶的作用,獲得兩條完整的互補(bǔ)雙鏈。在合成基因的結(jié)構(gòu)中,應(yīng)包括有克隆和表達(dá)所需要的全部信號(hào)及DNA順序,基因密碼的閱讀框架也應(yīng)該同表達(dá)體系相適應(yīng)。此外,由于不同種類(lèi)的生物體或密碼子的使用都具有明顯的選擇性,在基因合成和克隆時(shí)必須考慮這個(gè)問(wèn)題。選擇合適的密碼子,以獲得高效表達(dá)。

1.2 合成探針
  基因的克隆和分離已成為現(xiàn)代分子生物這研究必不可少的手段。DNA合成技術(shù)在其中起著越來(lái)越重要的作用。它不僅使得過(guò)去頗費(fèi)周折的基因篩選與鑒定成為常規(guī)技術(shù),而且使得克隆載體的構(gòu)建及克隆基因和載體的連接變得更加容易和準(zhǔn)確。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以通過(guò)mRNA的結(jié)構(gòu)間接地得出。相反,如果已知某個(gè)肽段的氨基酸順序,也可根據(jù)密碼簡(jiǎn)并的原則推導(dǎo)出所有可能的mRNA序列密碼。人工合成的具有特定順序的寡聚DNA片段,已應(yīng)用于篩選和鑒定重組質(zhì);颚耸删w。實(shí)驗(yàn)證明用合成的寡核苷酸片段,即使只有1對(duì)堿基錯(cuò)配采用嚴(yán)謹(jǐn)條件雜交也能與完全互補(bǔ)的雙鏈相區(qū)別。因此,使用作探針的寡核苷酸,應(yīng)將密碼的簡(jiǎn)并度調(diào)至最高限度時(shí),可減少假陽(yáng)性,增加篩選的準(zhǔn)確率。

1.3 合成引物
  1.合成PCR引物進(jìn)行基因擴(kuò)增:PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。該法操作簡(jiǎn)便,可在短時(shí)間內(nèi)在試管中獲得數(shù)百萬(wàn)特異DNA序列拷貝。PCR技術(shù)的特異性取決于所用引物和模板DNA結(jié)合的特異性。合成引物在PCR反應(yīng)中的使用。
  2.序列測(cè)定用引物:DNA序列測(cè)定是分子生物學(xué)中最重要和最精細(xì)的研究技術(shù),其中最常使用的是末端終止法,即是一種依賴(lài)于特異DNA引物的序列測(cè)定方法,此外該法對(duì)模板的需要量較大,這就要求待測(cè)DNA片段尤其是拷貝數(shù)少的片段首先克隆到適合的載體中經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后進(jìn)行序列測(cè)定。常用的克隆載體如M13、pUC19、PBR322等均可購(gòu)到有商品出售的公用測(cè)序引物。
3.合成導(dǎo)入突變用的引物:利用寡核苷酸引導(dǎo)的突變,可在目的DNA序列的任何部分產(chǎn)生點(diǎn)突變、插入和缺失,從而使得基因編碼的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生改變。

1.4 合成連接子和接頭

在DNA重組中常需要將外源DNA片段插入某些載體DNA中。如果載體或外源DNA上沒(méi)有合適的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn),為提高插入效率或?qū)崿F(xiàn)定向克隆,可采用合成連接子(linker)和接頭(adaptor)的方法。使用連接子和接頭需要插入片段是平末端,否則,首先需要用DNA聚合酶I大片段補(bǔ)齊或者用核酸酶S1或Bal31處理得到平末端后才可同連接子或接頭連接。

具有多酶切點(diǎn)的接頭(polylinker)還廣泛應(yīng)用于構(gòu)建某些運(yùn)載體,使之帶有多個(gè)新的酶切位點(diǎn)。這在質(zhì)粒pUC系列及用于序列分析的M13mp噬菌體系統(tǒng)中都得到了廣泛的應(yīng)用。接頭片段帶用來(lái)調(diào)整表達(dá)載體的讀碼框架,用于基因表達(dá)及功能的研究。

2 合成基因在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

  隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)已逐步從整體和器官的水平深入到細(xì)胞分子水平。醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn),許多嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病,如遺傳性疾病、腫瘤、心血管疾病等可在基因結(jié)構(gòu)上找到某些變化,如基因的缺失、突變、轉(zhuǎn)位或致病左因的存在,以此作為證據(jù)亦可對(duì)這些疾病作同相應(yīng)的判斷。例如鐮刀狀細(xì)胞貧血癥即是由于A(yíng)→T突變?cè)斐搔?珠蛋白第六位谷氨酸變?yōu)槔i氨酸,從而造成珠蛋白結(jié)構(gòu)異常,并引起紅細(xì)胞形態(tài)及對(duì)氧的親合力發(fā)生改變。通過(guò)人工合成的19個(gè)核苷酸作為探針即可明確區(qū)別正常人、雜合和純合的病人。目前,合成DNA探針已廣應(yīng)用于臨床,成為一種有效的診斷手段。

2.1 用于遺傳病的診斷
  過(guò)去僅有少數(shù)遺傳性疾病可以憑借蛋白質(zhì)和酶學(xué)方面的異常作出判斷,隨著分子生物這的發(fā)展,對(duì)遺傳病的診斷有了巨大的進(jìn)步,出現(xiàn)了基因診斷法。醫(yī)學(xué)上使用基因診斷法最早成功的報(bào)道是1985年Saiki等人對(duì)鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的診斷。另外,對(duì)于以突變?yōu)橹鞯摩?地中海貧血,以合成DNA片段為探針,亦可得同滿(mǎn)意的結(jié)果。

2.2 用于傳染病的診斷
  臨床上對(duì)傳染性疾病的傳統(tǒng)診斷程序常常是檢濁病原體及其抗體,需時(shí)較長(zhǎng),達(dá)不到早期診斷的目的。合成探針在傳染病特別是由病毒感染性所致的傳染病檢測(cè)中,已得到廣泛應(yīng)用,尤其是結(jié)合PCR方法使診斷的靈敏度可進(jìn)一步提高,目前國(guó)內(nèi)已制出檢測(cè)乙肝病毒、艾滋病病毒(HIV)、輪狀病毒和皰疹疾病等多種基因探針診斷試劑盒。
  人工合成核酸在醫(yī)學(xué)上不僅可以作為一種手段,而且在某些疾病的治療上顯露了端倪寡聚核苷酸及其衍生物對(duì)腫瘤的治療已經(jīng)取得可喜的進(jìn)展。作為蛋白質(zhì)翻譯抑制劑的寡核苷酸現(xiàn)稱(chēng)為反義RNA或反義DNA。其作用原理可能有以下幾種:①反義RNA與體內(nèi)靶mRNA結(jié)合形成雙螺旋,使mRNA不能成為翻譯蛋白質(zhì)的模板。②反義RNA(DNA)與DNA結(jié)合。影響DNA復(fù)制。③反義RNA能阻止mRNA與核蛋白體結(jié)合,降低蛋白質(zhì)合成效率。
  反義RNA或反義DNA最近年來(lái)國(guó)際上研究課題的熱點(diǎn),人們寄希望它在抗病毒,尤其是對(duì)艾滋病和腫瘤基因治療上發(fā)揮重要,為征服這兩類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病作出貢獻(xiàn)。

 

 
  • 下一篇:暫無(wú)
  • 上一篇:暫無(wú)

 

 
推薦圖文
推薦食品專(zhuān)題
點(diǎn)擊排行
 
 
Processed in 0.376 second(s), 832 queries, Memory 4.11 M