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RNA酶活性的控制

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-04-26

 

  為了獲得高質量的真核細胞mRNA, 必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法,最大限度地降低細胞破碎過程中所釋放的RNA酶的活性。同時,避免偶然引入實驗室內其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶法染問題的一些注意事項。大多數有經驗的研究者并不拘泥于這些注意事項,只是在遇到問題時可能采用其中的一種或幾種方法加以解決。

 (一)實驗程序

  如不謹慎操作,外源性RNA酶可以通過下述途徑污染RNA制品:
(1)玻璃制品、塑料制品和電泳槽 滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶,可以不經預處理直接用于制備和貯存RNA。實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經常有RNA酶法染,使用前必須于180 ℃干烤8小時或更長時間(玻璃器皿)或用氯仿沖洗(塑料制品)。另一種方法是用0.1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強烈抑制劑,但其作用并不是絕對的(Fedorcsak和Ehrenberg,1966)。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小時,然后用滅菌水淋洗數次, 并于100℃干烤15分鐘(Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高壓蒸氯滅菌15分鐘。上述處理可以除去器甲上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。
  羧甲基化的RNA在無細胞體系中翻譯效率很低,然而,除非其中大部分嘌呤堿基均被修飾,否則其形成DNA:RNA或RNA:RNA雜交休的能力并不明顯降低。用于RNA電泳的電泳槽應用去污劑洗干凈,再用水沖洗,用乙醇干燥,然后灌滿3%的H2O2溶液,于室溫放置10分鐘,然后用0.1 %DEPC處理過的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標記,存放在指定地點,為RNA實驗專用。
(2)研究人員造成的污染 RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此,在準備分離的和分析RNA的材料和溶液時,主有涉及RNA的一切操作過程中,都應戴一次性手套,接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此進行RNA實驗時應勤換手套。
(3)污染的溶液 用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿?赡艿脑捜芤壕鶓0.1%DEPC于37℃至少處理12小時,然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。注:DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學反應,因些不能用來處理含有Tris 一類的緩沖液?纱鎺灼啃碌奈撮_封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。

(二)RNA酶的抑制劑

下面介紹3種廣泛應用的特異性RNA酶抑制劑。
(1)RNA酶的蛋白質抑制劑是 從人胎盤分離的一種蛋白質可與多種RNA酶緊密結合(KI≈3x1010)形成非共價結合的等摩爾復合物,使RNA酶失活。此蛋白質體內可能是血管生成素的抑制劑,血管生成素是氨基酸序列和推測的三級結構與胰RNA酶類似的一種血管生成因子, 幾個廠家以不同的商品名出售這種抑制劑,該蛋白質應置于含5mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)的50%甘油中,貯存于-20℃。抑制劑制品凍融數次后或放置在氧化條件下即應棄之不用,因為上述處理會使蛋白質變性從而釋放出所結合的RNA酶。因此,在使用變性劑裂解哺乳動物細胞這一提取RNA的初始步聚中不應使用這種蛋白抑制劑。然而職用更溫和的裂解方法時應使用這種抑制劑,并且在后續(xù)的所有RNA純化步驟中均應有此蛋白質存在。由于酚抽提可以除蛋白質抑制劑,故應在純化過程中補加幾次抑制劑。其最大活性的發(fā)揮要求巰基試劑,而且它并不干擾反轉錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯。
(2)氧釩核糖核苷復合物 這種由氧釩(1V)離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復合物,是量種過渡態(tài)類似物,它能與多種RNA酶結合并幾科能百分之百地抑制RNA酶的活性。這4種氧釩核糖核苷復合物可加入完整細胞中,在RNA提取和純化的所有過程中,其使用濃度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母細胞中進行翻譯, 并能作為某些外酶促反應(如mRNA反轉錄)的模板。然而氧釩核糖核苷復合物強烈抑制mRNA在無細胞體系中的翻譯,因此必須用含0.1 %羥基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有幾家公司出售氧釩核糖核苷復合物。
(3)Macaloid(硅藻上)Macaloid是一咱粘土,很多年前就發(fā)現它能吸附RNA酶,用緩沖液將其制成漿液,以0.015%(W/V)的終濃度溶解細胞。 這種粘土隨同它所吸附的RNA酶可在后續(xù)的RNA純化過程中(如酚抽提后)經離心去除。

(三)破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法


  用強烈變性如鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質, 導致細胞結構破碎,核蛋白由于其二級結構的破壞而從核酸上解離下來。RNA酶可耐受多種處理等,因此可聯(lián)用上述試劑,從組織中,如富含RNA酶的胰腺中,提取完整無損的RNA。下述實驗程序系列利用RNA酶抑制劑和(或)能迅速滅活RNA酶的有關方法從組織或細胞培養(yǎng)物中分離總RNA、核內RNA和胞質內RNA。

 
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