亚洲成aⅴ人在线观看_亚洲欧美日韩综合一区在线观看_国产无码电影一区二区三区_国语精品91自产拍在线观看二区

VIP標(biāo)識 上網(wǎng)做生意,首選VIP會員| 設(shè)為首頁| 加入桌面| | 手機版| RSS訂閱
食品伙伴網(wǎng)服務(wù)號
 

基因突變的檢測方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點之一,檢測方法也隨之迅速發(fā)展。人類細胞癌基因的突變類型已如上所述,對于基因突變的檢測,1985以前,利用Southern印跡法,可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。對于用該法法不能檢測的突變,只能應(yīng)用復(fù)雜費時的DNA序列測定分析法。多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)是突變研究中的最重大進展,使基因突變檢測技術(shù)有了長足的發(fā)展,目前幾乎所有的基因突變檢測的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR的基礎(chǔ)之上,并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn),目前已達二十余種,自動化程度也愈來愈高,分析時間大大縮短,分析結(jié)果的準確性也有很大很提高。其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand comformational polymorphism,SSCP)和異源雙鏈分析法(heteroduplex analysis,HA)。下面分別介紹幾種PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典突變檢測方法,可根據(jù)檢測目的和實驗室條件選擇時參考。

PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上,短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構(gòu)象,一個堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu),這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成,即使一個堿基的不同,也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)而出刺同的遷移率。由于該法簡單快速,因而被廣泛用于未知基因突變的檢測。用PCR-SSCP法檢測小于200bp的PCR產(chǎn)物時,突變檢出率可達70%-95%,片段大于400bp時,檢出率僅為50%左右,該法可能會存在1%的假陽性率。應(yīng)用PCR-SSCP法應(yīng)注意電泳的最佳條件,一般突變類型對檢測的靈敏度無大的影響,同時該法不能測定突變的準確位點,還需通過序列分析來確定。Sarkar等認為對于大于200bp的片段,用其RNA分子來做SSCP會提高其錄敏度。應(yīng)用PCR-SSCP檢測點突變已見報道于人類大部分的腫瘤組織或細胞,如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因,也是檢測抑癌基因p53突變最常用的方法,僅檢測第5-8外顯子即可發(fā)現(xiàn)85%以上的p53基因突變。由于該法簡便快速,特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。

異源雙鏈分析法(HA) HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一突起,在非變性凝膠中電泳時,會產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似,所不同的是SSCP分離的是單鏈DNA,HA法分離的是雙鏈DNA,也只適合于小片段的分析。但HA對一些不能用SSCP檢出的突變有互補作用,兩者結(jié)合使用,可使突變檢出率提高到近100%。

突變體富集PCR法(mutant-enriched PCR)本法的基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點,如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點,第13密古巴子有BgⅠⅡ位點。用鏈續(xù)二次的巢式PCR來擴增包括K-ras第12、13密碼子的DNA片段,在兩次擴增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴增的DNA片段,野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增,而突變型則能完整進入第二次PCR擴增并得到產(chǎn)物的富集。

變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradinent electrophoresis,DGGE) DGGE法分析PCR產(chǎn)物,如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域,檢出率可達100%,檢測片段可達1kb,最適圍為100bp-500bp;驹砘诋(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時,DNA發(fā)生部分解鏈,電泳適移率下降,當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時,會在不同的時間發(fā)生解鏈,因影響電泳速度變化的程
而被分離。由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測,需要一套專用的電泳裝置,合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾,以利于檢測發(fā)生于高熔點區(qū)的突變。在DGGE的基礎(chǔ)上,又發(fā)展了用濕度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法(溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE)。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置,該法一經(jīng)建立,操作也較簡便,適合于大樣本的檢測篩選。

化學(xué)切割錯配法(chemical cleavage of mismatch,CCM)CCM為在Maxam-Gilbert測序法的基礎(chǔ)上發(fā)展的一項檢測突變的技術(shù),其檢測突變的準確性可與DNA測序相仿。其基本原理為將待測含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俁變性雜交,在異源雜合的雙鏈核酸分子中,錯配的C能被羥胺或哌啶切割,錯配的T能被四氧化餓切割,經(jīng)變性凝膠電泳即可確定是否存在突變。該法檢出率很高,也是檢片段最長的方法,已有報功檢測了1.7kb片段,如果同時對正、反義鏈進行分析,檢出率可達100%。應(yīng)用熒光檢測系統(tǒng)可增強敏感度,可檢測到10個細胞中的1個突變細胞。該法中的化學(xué)試劑有毒,又發(fā)展了碳二亞胺檢測法(catodiimide,CDI),CDI為無毒物質(zhì),也可檢測大片段DNA的點突變。

等位基因特異性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide,ASO) ASO為一種以雜交為基礎(chǔ)對已知突變的檢測技術(shù)。以PCR和ASO相結(jié)合,設(shè)計一段20bp左右的寡核苷酸片段,其中包含了發(fā)生突變的部位,以此為探針,與固定在膜上的經(jīng)PCR拉增的樣品DNA雜交。可以用各種突變類型的寡核苷酸探針,同時以野生型探針為對照,如出現(xiàn)陽性雜交帶,則表運河樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點突變,ASO需嚴格控制雜交條件和設(shè)置標(biāo)準對照避免假陽性和假陰性。目前已有商品化的檢測盒檢測部分癌基因ASO突變。

DNA芯片技術(shù)(DNA chip)DNA芯片技術(shù)是90年代后發(fā)展的一項DNA分析新技術(shù),它集合了集成電路計算機、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)記探針和DNA合成等先進技術(shù)?捎糜诨蚨ㄎ、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突變檢測方面DNA芯片也有廣闊的前景,其基本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上,彼此之間重疊1個堿基,并覆蓋全部所需檢測的基因,將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA發(fā)別與2塊DNA芯片雜交,由于至少存在1個堿基的差異,正常和突變的DNA將會得到不同的雜交圖譜,經(jīng)過共聚集顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號,即可確定是否存在突變,該方法快速簡單、片動化程度高,具有很大的發(fā)展?jié)摿,將在基因突變檢測中心發(fā)揮非常重要的作用。

連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reaction,LCR) 與其他核酸擴增技術(shù)比較,其最大特點為可準確區(qū)分基因序列中單個基因突變,由Landegree于1988年首次應(yīng)用于鐮刀獎細胞貧血的分子診斷。LCR是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5`-磷酸與另一相鄰鏈3`-羥基連接為基礎(chǔ),應(yīng)用兩對互補的引物,雙鏈DNA經(jīng)加熱變性后,兩對引物分別與模板復(fù)性,若完全互補,則在連接酶的作用下,使相鄰兩引物的5`-磷酸與3`-羥基形成磷酸二酯二酯鍵而連接,前一次的連接產(chǎn)物又作為下一次循環(huán)反應(yīng)的模板,如果配對的堿基存在突變則不能連接和擴增。LCR產(chǎn)物檢測最初是通過這32p標(biāo)記上游引物3`未端,經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加以鑒定,其檢測敏感性達到200個靶分子。也可設(shè)計1個橫跨兩引物的檢測探針,用它與LCR產(chǎn)物進行雜交檢測。近年有應(yīng)用熒光素、地高辛等非核素標(biāo)記方法。Batt在1994年發(fā)展了一種更為簡的方法,好微孔板夾心雜交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性,以及能檢測單個堿基突變的能力,因此被應(yīng)用于腫瘤基因突變的分子診斷,并與PCR結(jié)合用以提高其敏感性。


等位基因特異性擴增法(Allele-specific amplification,ASA)ASA于1989年建立,是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展,也稱擴增阻礙突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)、等位基因特性PCR(allele-specific PCR,ASPCR)等,用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設(shè)計兩個5`端引物,一個與正常DNA互補,一個與突變DNA互補,對于純合性突變,分別加入這兩種引物及3`端引物進行兩個平行PCR,吸有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的3`端則導(dǎo)致PCR不能延伸,則稱為ARMS。ARMS和ASPCR借鑒多重PCR原理,可在同一系統(tǒng)中同時檢測兩種或多種等位基因突變位點。ASA法的檢出率依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DNA有氏配時錯配延伸,特別是當(dāng)錯配堿基為G:T時,這時可通過調(diào)整實驗條件如引物靶DNA,Taq DNA聚合酶的濃度等來得高瓜在特異性。在反應(yīng)體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴增。還可通過在引物3`端的第二個堿基引入一個錯配堿基,使之與模板之間形成雙重錯配以阻止錯誤延伸。

 

RNA酶A切割法(RNase A cleavage)在一定條件下,氨基源雙鏈核酸分子RNA:RNA或RNA:DNA中的錯配堿基可被RNaseA切割,切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離。當(dāng)RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時,RNaseA在錯配處的切割效率很低,甚至不切割,而當(dāng)錯配堿基為嘧啶時,則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個條鏈,突變檢出率只有30%,如同時分析正義和反義二條鏈,檢出率可達70%。該法需要制備RNA探針,增加了操作的復(fù)雜性,但可用于1-2kb的大片段進行檢測,并能確定突變位點。于這些優(yōu)越性,它仍被作為一種經(jīng)典方法用于對未知突變進行分析。

 

染色體原位雜交(In situ hybridization of chromosome)染色體發(fā)現(xiàn)距今已有150多年的歷史,染色體檢測被廣泛用于動、植物及人類的細胞遺傳學(xué)研究,隨著染色體分技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展。染色體研究范圍也不斷擴大,特別是用于腫瘤分子診斷。腫瘤細胞的染色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象,可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類。在腫瘤形成的生物學(xué)基礎(chǔ)方面,原發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關(guān),腫瘤細胞中可以發(fā)現(xiàn)各種形式的染色體畸變,如缺失、重復(fù)、易位、重排、單體斷裂及核內(nèi)復(fù)制等;繼發(fā)性變化主要是腫瘤細胞核型的改變。染色體的檢測對于腫瘤的診斷、鑒別診斷、生物學(xué)行為判別等方面都重要意義。染色體的檢測方法進展很快,檢測的精確率也不斷提高,這里主要介紹熒光原位雜交和PRINS法。

熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridiaation,FISH)創(chuàng)建于1986年。1969年Gall和Pardue首先應(yīng)用核素標(biāo)記核苷酸制備探針,通過放射自顯影檢測雜交信號。應(yīng)用核素標(biāo)記的探針其敏感性可以檢測到中期染色體上幾百
堿基的單拷貝靶核苷酸序列,敏感性雖高,但定位不夠精確。FISH具有探針穩(wěn)定、操作安全,可快速、多色顯示多個不同探針的雜交信號等優(yōu)點。FISH的靈敏感與探針標(biāo)記方法和檢測儀器性能有關(guān),探針標(biāo)記時摻入的修飾核苷酸比例直接影響雜交信號強度。FISH探針一般采用隨機引物法或切口翻譯法,如將PCR技術(shù)引入FISH探針標(biāo)記,可使其靈敏度提高到0.25kb。應(yīng)用慢掃描CCD配合影像處理理軟件,增強信噪比,有利于檢測微弱信號,如應(yīng)用TSA系統(tǒng)(tyramide signal amplification)能將雜交信號再放大1000倍,可用于單拷貝基因的定位。FISH分辨率大約為1-3Mb,如果應(yīng)用強變性劑處理染色體,讓DNA分子從蛋白質(zhì)中分離出來,使雙DNA完全伸展并粘附在玻片上,經(jīng)引處理后,分辨率可達1-2kb。還可采用對分裂中期染色體進行顯微解剖(microdissect)法以提高分辨率。FISH的另一個特點是可以聯(lián)合慶用地高辛、生物素等多種標(biāo)記系統(tǒng), 在一次雜交中可檢測多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關(guān)系,即多色FISH或多靶FISH。FISH技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中的基因擴增、易位重排及缺失等的檢測,在腫瘤診斷和鑒別診斷、預(yù)后和治療監(jiān)控等方面都有重要意義。

Klch等于1989年發(fā)明了染色體上寡核苷酸引物原位DNA合成技術(shù)(oligonucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS),并成功地用于染色體特異α衛(wèi)星DNA標(biāo)記。其基本原理是用非標(biāo)記的寡核苷酸引物同染色體上靶序列特異性地雜交,在DNA聚合酶作用下,當(dāng)引物延伸時,摻入標(biāo)記的核革酸可直接或間接地檢量標(biāo)記位點。PRINS技術(shù)的優(yōu)點是不需克隆基因作探針,且由于雜交反應(yīng)在前,標(biāo)記在后,故非特異懷背景低。缺點是信號弱,靈敏度低,為克服這一制瞇,Terkelsen等建立了重復(fù)引物原位標(biāo)記技術(shù)(repeated PRINS),重復(fù)進行PRINS反應(yīng),使信號號強度明顯提高;贔ISH的原理,發(fā)展了多色原位經(jīng)物標(biāo)記(multicolor PRINS),可測定二個以上靶序列在DNA分子上的相互的位置,且特異性比FISH還高。

DNA序列分析(DNA sequencing) 應(yīng)用各種突變檢測技術(shù)檢測到的基因突變,最后都需用序列分析才能確定突變類型及突變位置,其效率可以達到100%,F(xiàn)在的測序方法已與經(jīng)典的方法有了很大的不同,其基本原理雖仍是雙脫氧終止法,但自動化程度大為提高,操作更簡便,測序時間也大大縮短。隨著PCR技術(shù)與測序聯(lián)合使用,不需經(jīng)過M13亞克隆步驟,故稱為直接測序法(direct sequencing,DS)。DS法測序的模板主主要來源于PCR,應(yīng)用不對稱PCR(asymmetric PCR)和基因組擴增轉(zhuǎn)錄同步測序法(genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS)等,使單鏈產(chǎn)物大大增加。近年來,PCR循環(huán)測序法的建立,使模板擴增與同步進行,引物用四種不同前顏色的熒光標(biāo)記,使每個樣品的四個測序反應(yīng)可在一個反應(yīng)管和一個泳道內(nèi)進行,大大提高了測鄧的自動化程度。目前PE公司推同出的DNA自動測序儀已發(fā)展到96泳道,并仍在不斷改進。這些高度自動化的測序方法是經(jīng)較理想的基因突變分析技術(shù),但其昂貴的費用其使用范圍,所以對一些小樣本或為了某些特定目的的樣本分析,仍進行經(jīng)典的手工測序。

突變基因的檢測方法多種多樣,特別是PCR技術(shù)誕生后,許多檢測技術(shù)都是在PCR基礎(chǔ)上衍生的。由于PCR擴增南非要的模板量少,使對腫瘤的突變分析可以精確到單細胞,如霍奇金病的R-S細胞的單細胞基因突變分析。另外,應(yīng)用顯微解剖法(microdissection)可在組織切片上較精確地挑選需檢測的靶點,其優(yōu)點是可克服腫瘤組只中間質(zhì)或癌周組織的混雜,提高準確性。除上述介紹的方法外,還有多種方法也用于基因突變的分子檢測,如對未知突變基因進行分析的酶促切割錯配法(enzyme mismatc cleavage,EMC)、切割片段長度多態(tài)性(cleavage fragment length polymor phism,CEFLP)、雙脫氧指紋圖譜法(dideoxy finger printing,ddF)、錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法(protein truncation test,PTT)等。對已知突變基因進行分析 的有引物延伸法(primer extension,PEX)、寡核苷酸鏈接檢測法(oligonucleotide ligation assay,OLA)、毛細管電泳法(capillary electrophoresis,CE)等方法。

 

 

 
推薦圖文
推薦食品專題
點擊排行
 
 
Processed in 0.114 second(s), 17 queries, Memory 0.89 M