基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點之一，檢測方法也隨之迅速發(fā)展。人類細胞癌基因的突變類型已如上所述，對于基因突變的檢測，1985以前，利用Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。對于用該法法不能檢測的突變，只能應(yīng)用復(fù)雜費時的DNA序列測定分析法。多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)是突變研究中的最重大進展，使基因突變檢測技術(shù)有了長足的發(fā)展，目前幾乎所有的基因突變檢測的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR的基礎(chǔ)之上，并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，目前已達二十余種，自動化程度也愈來愈高，分析時間大大縮短，分析結(jié)果的準確性也有很大很提高。其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和異源雙鏈分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分別介紹幾種PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典突變檢測方法，可根據(jù)檢測目的和實驗室條件選擇時參考。
PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構(gòu)象，一個堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成，即使一個堿基的不同，也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)而出刺同的遷移率。由于該法簡單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測。用PCR-SSCP法檢測小于200bp的PCR產(chǎn)物時，突變檢出率可達70％-95％，片段大于400bp時，檢出率僅為50％左右，該法可能會存在1％的假陽性率。應(yīng)用PCR-SSCP法應(yīng)注意電泳的最佳條件，一般突變類型對檢測的靈敏度無大的影響，同時該法不能測定突變的準確位點，還需通過序列分析來確定。Sarkar等認為對于大于200bp的片段，用其RNA分子來做SSCP會提高其錄敏度。應(yīng)用PCR-SSCP檢測點突變已見報道于人類大部分的腫瘤組織或細胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測抑癌基因p53突變最常用的方法，僅檢測第5-8外顯子即可發(fā)現(xiàn)85％以上的p53基因突變。由于該法簡便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。
異源雙鏈分析法（HA） HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的是單鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA，也只適合于小片段的分析。但HA對一些不能用SSCP檢出的突變有互補作用，兩者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高到近100％。
突變體富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點，如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點，第13密古巴子有BgⅠⅡ位點。用鏈續(xù)二次的巢式PCR來擴增包括K-ras第12、13密碼子的DNA片段，在兩次擴增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增并得到產(chǎn)物的富集。
變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR產(chǎn)物，如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域，檢出率可達100％，檢測片段可達1kb，最適圍為100bp-500bp�；驹砘诋�(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳適移率下降，當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程
而被分離。由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測發(fā)生于高熔點區(qū)的突變。在DGGE的基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用濕度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置，該法一經(jīng)建立，操作也較簡便，適合于大樣本的檢測篩選。
化學(xué)切割錯配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM為在Maxam-Gilbert測序法的基礎(chǔ)上發(fā)展的一項檢測突變的技術(shù)，其檢測突變的準確性可與DNA測序相仿。其基本原理為將待測含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俁變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯配的C能被羥胺或哌啶切割，錯配的T能被四氧化餓切割，經(jīng)變性凝膠電泳即可確定是否存在突變。該法檢出率很高，也是檢片段最長的方法，已有報功檢測了1.7kb片段，如果同時對正、反義鏈進行分析，檢出率可達100％。應(yīng)用熒光檢測系統(tǒng)可增強敏感度，可檢測到10個細胞中的1個突變細胞。該法中的化學(xué)試劑有毒，又發(fā)展了碳二亞胺檢測法（catodiimide,CDI）,CDI為無毒物質(zhì)，也可檢測大片段DNA的點突變。
等位基因特異性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO為一種以雜交為基礎(chǔ)對已知突變的檢測技術(shù)。以PCR和ASO相結(jié)合，設(shè)計一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR拉增的樣品DNA雜交。可以用各種突變類型的寡核苷酸探針，同時以野生型探針為對照，如出現(xiàn)陽性雜交帶，則表運河樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點突變，ASO需嚴格控制雜交條件和設(shè)置標(biāo)準對照避免假陽性和假陰性。目前已有商品化的檢測盒檢測部分癌基因ASO突變。
DNA芯片技術(shù)（DNA chip）DNA芯片技術(shù)是90年代后發(fā)展的一項DNA分析新技術(shù)，它集合了集成電路計算機、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)記探針和DNA合成等先進技術(shù)�？捎糜诨蚨ㄎ�、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突變檢測方面DNA芯片也有廣闊的前景，其基本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此之間重疊1個堿基，并覆蓋全部所需檢測的基因，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA發(fā)別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個堿基的差異，正常和突變的DNA將會得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過共聚集顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號，即可確定是否存在突變，該方法快速簡單、片動化程度高，具有很大的發(fā)展?jié)摿�，將在基因突變檢測中心發(fā)揮非常重要的作用。
連接酶鏈反應(yīng)（ligase chain reaction,LCR） 與其他核酸擴增技術(shù)比較，其最大特點為可準確區(qū)分基因序列中單個基因突變，由Landegree于1988年首次應(yīng)用于鐮刀獎細胞貧血的分子診斷。LCR是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5`-磷酸與另一相鄰鏈3`-羥基連接為基礎(chǔ)，應(yīng)用兩對互補的引物，雙鏈DNA經(jīng)加熱變性后，兩對引物分別與模板復(fù)性，若完全互補，則在連接酶的作用下，使相鄰兩引物的5`-磷酸與3`-羥基形成磷酸二酯二酯鍵而連接，前一次的連接產(chǎn)物又作為下一次循環(huán)反應(yīng)的模板，如果配對的堿基存在突變則不能連接和擴增。LCR產(chǎn)物檢測最初是通過這32p標(biāo)記上游引物3`未端，經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加以鑒定，其檢測敏感性達到200個靶分子。也可設(shè)計1個橫跨兩引物的檢測探針，用它與LCR產(chǎn)物進行雜交檢測。近年有應(yīng)用熒光素、地高辛等非核素標(biāo)記方法。Batt在1994年發(fā)展了一種更為簡的方法，好微孔板夾心雜交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能檢測單個堿基突變的能力，因此被應(yīng)用于腫瘤基因突變的分子診斷，并與PCR結(jié)合用以提高其敏感性。
等位基因特異性擴增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于1989年建立，是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱擴增阻礙突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設(shè)計兩個5`端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補，對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3`端引物進行兩個平行PCR，吸有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的3`端則導(dǎo)致PCR不能延伸，則稱為ARMS。ARMS和ASPCR借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時檢測兩種或多種等位基因突變位點。ASA法的檢出率依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DNA有氏配時錯配延伸，特別是當(dāng)錯配堿基為G：T時，這時可通過調(diào)整實驗條件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的濃度等來得高瓜在特異性。在反應(yīng)體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴增。還可通過在引物3`端的第二個堿基引入一個錯配堿基，使之與模板之間形成雙重錯配以阻止錯誤延伸。
RNA酶A切割法（RNase A cleavage）在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的錯配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離。當(dāng)RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時，RNaseA在錯配處的切割效率很低，甚至不切割，而當(dāng)錯配堿基為嘧啶時，則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個條鏈，突變檢出率只有30％，如同時分析正義和反義二條鏈，檢出率可達70％。該法需要制備RNA探針，增加了操作的復(fù)雜性，但可用于1-2kb的大片段進行檢測，并能確定突變位點。于這些優(yōu)越性，它仍被作為一種經(jīng)典方法用于對未知突變進行分析。
染色體原位雜交（In situ hybridization of chromosome）染色體發(fā)現(xiàn)距今已有150多年的歷史，染色體檢測被廣泛用于動、植物及人類的細胞遺傳學(xué)研究，隨著染色體分技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展。染色體研究范圍也不斷擴大，特別是用于腫瘤分子診斷。腫瘤細胞的染色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象，可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類。在腫瘤形成的生物學(xué)基礎(chǔ)方面，原發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關(guān)，腫瘤細胞中可以發(fā)現(xiàn)各種形式的染色體畸變，如缺失、重復(fù)、易位、重排、單體斷裂及核內(nèi)復(fù)制等；繼發(fā)性變化主要是腫瘤細胞核型的改變。染色體的檢測對于腫瘤的診斷、鑒別診斷、生物學(xué)行為判別等方面都重要意義。染色體的檢測方法進展很快，檢測的精確率也不斷提高，這里主要介紹熒光原位雜交和PRINS法。
熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridiaation,FISH）創(chuàng)建于1986年。1969年Gall和Pardue首先應(yīng)用核素標(biāo)記核苷酸制備探針，通過放射自顯影檢測雜交信號。應(yīng)用核素標(biāo)記的探針其敏感性可以檢測到中期染色體上幾百
堿基的單拷貝靶核苷酸序列，敏感性雖高，但定位不夠精確。FISH具有探針穩(wěn)定、操作安全，可快速、多色顯示多個不同探針的雜交信號等優(yōu)點。FISH的靈敏感與探針標(biāo)記方法和檢測儀器性能有關(guān)，探針標(biāo)記時摻入的修飾核苷酸比例直接影響雜交信號強度。FISH探針一般采用隨機引物法或切口翻譯法，如將PCR技術(shù)引入FISH探針標(biāo)記，可使其靈敏度提高到0.25kb。應(yīng)用慢掃描CCD配合影像處理理軟件，增強信噪比，有利于檢測微弱信號，如應(yīng)用TSA系統(tǒng)（tyramide signal amplification）能將雜交信號再放大1000倍，可用于單拷貝基因的定位。FISH分辨率大約為1-3Mb,如果應(yīng)用強變性劑處理染色體，讓DNA分子從蛋白質(zhì)中分離出來，使雙DNA完全伸展并粘附在玻片上，經(jīng)引處理后，分辨率可達1-2kb。還可采用對分裂中期染色體進行顯微解剖（microdissect）法以提高分辨率。FISH的另一個特點是可以聯(lián)合慶用地高辛、生物素等多種標(biāo)記系統(tǒng)， 在一次雜交中可檢測多種探針在染色體上的位置及探針間的相互關(guān)系，即多色FISH或多靶FISH。FISH技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中的基因擴增、易位重排及缺失等的檢測，在腫瘤診斷和鑒別診斷、預(yù)后和治療監(jiān)控等方面都有重要意義。
Klch等于1989年發(fā)明了染色體上寡核苷酸引物原位DNA合成技術(shù)（oligonucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS）,并成功地用于染色體特異α衛(wèi)星DNA標(biāo)記。其基本原理是用非標(biāo)記的寡核苷酸引物同染色體上靶序列特異性地雜交，在DNA聚合酶作用下，當(dāng)引物延伸時，摻入標(biāo)記的核革酸可直接或間接地檢量標(biāo)記位點。PRINS技術(shù)的優(yōu)點是不需克隆基因作探針，且由于雜交反應(yīng)在前，標(biāo)記在后，故非特異懷背景低。缺點是信號弱，靈敏度低，為克服這一制瞇，Terkelsen等建立了重復(fù)引物原位標(biāo)記技術(shù)（repeated PRINS）,重復(fù)進行PRINS反應(yīng)，使信號號強度明顯提高�；贔ISH的原理，發(fā)展了多色原位經(jīng)物標(biāo)記（multicolor PRINS）,可測定二個以上靶序列在DNA分子上的相互的位置，且特異性比FISH還高。
DNA序列分析（DNA sequencing） 應(yīng)用各種突變檢測技術(shù)檢測到的基因突變，最后都需用序列分析才能確定突變類型及突變位置，其效率可以達到100％�，F(xiàn)在的測序方法已與經(jīng)典的方法有了很大的不同，其基本原理雖仍是雙脫氧終止法，但自動化程度大為提高，操作更簡便，測序時間也大大縮短。隨著PCR技術(shù)與測序聯(lián)合使用，不需經(jīng)過M13亞克隆步驟，故稱為直接測序法（direct sequencing,DS）。DS法測序的模板主主要來源于PCR，應(yīng)用不對稱PCR（asymmetric PCR）和基因組擴增轉(zhuǎn)錄同步測序法（genomic amplification with transcript sequencing,GAWTS）等，使單鏈產(chǎn)物大大增加。近年來，PCR循環(huán)測序法的建立，使模板擴增與同步進行，引物用四種不同前顏色的熒光標(biāo)記，使每個樣品的四個測序反應(yīng)可在一個反應(yīng)管和一個泳道內(nèi)進行，大大提高了測鄧的自動化程度。目前PE公司推同出的DNA自動測序儀已發(fā)展到96泳道，并仍在不斷改進。這些高度自動化的測序方法是經(jīng)較理想的基因突變分析技術(shù)，但其昂貴的費用其使用范圍，所以對一些小樣本或為了某些特定目的的樣本分析，仍進行經(jīng)典的手工測序。
突變基因的檢測方法多種多樣，特別是PCR技術(shù)誕生后，許多檢測技術(shù)都是在PCR基礎(chǔ)上衍生的。由于PCR擴增南非要的模板量少，使對腫瘤的突變分析可以精確到單細胞，如霍奇金病的R-S細胞的單細胞基因突變分析。另外，應(yīng)用顯微解剖法（microdissection）可在組織切片上較精確地挑選需檢測的靶點，其優(yōu)點是可克服腫瘤組只中間質(zhì)或癌周組織的混雜，提高準確性。除上述介紹的方法外，還有多種方法也用于基因突變的分子檢測，如對未知突變基因進行分析的酶促切割錯配法（enzyme mismatc cleavage,EMC）、切割片段長度多態(tài)性（cleavage fragment length polymor phism,CEFLP）、雙脫氧指紋圖譜法（dideoxy finger printing,ddF）、錯配接合蛋白質(zhì)截短測試法（protein truncation test,PTT）等。對已知突變基因進行分析 的有引物延伸法（primer extension,PEX）、寡核苷酸鏈接檢測法（oligonucleotide ligation assay,OLA）、毛細管電泳法（capillary electrophoresis,CE）等方法。
