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基因組文庫(kù)法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

一)基因組DNA分離、純化和加工

[Mbo I酶檢測(cè)]

1.準(zhǔn)備1.5ml小試管4個(gè);每管內(nèi)含有:

基因組DNA(在TE或水中) 10.0μg

10×Mbo I緩沖液 2.5μl

H2O 12.0μl

2.向每管中分別加入:0.1,0.5,1或2單位的Mbo I酶。

3.37℃保溫到5,10,20,40分鐘后,分別從每管中移出6μl,在干冰中貯存到下一步時(shí)一并使用。

4.把16個(gè)樣品在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,并與標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行比較。

5.選擇參數(shù)為:能產(chǎn)生平均大小約20kb的時(shí)間和Mbo I的濃度。


[Mbo I酶切]

1.根據(jù)上述酶切檢測(cè)結(jié)果,選用最佳酶切條件,并把酶的量加大100倍,用以消化1mg的基因組DNA;取1個(gè)10~15ml的塑料管,加入:

含1mg基因組DNA 1.0ml

Mbo I 按所測(cè)定的量加

10×Mbo I緩沖液 250.0μl

H2O 1.2ml

按前述(5)中所測(cè)定出的時(shí)間(產(chǎn)生20kb)于37℃保溫。

2.用2.5ml 1:1酚和氯仿混合物抽提DNA.

3.把上層水相移入一新管中,加275μl 5M的NaCl。

4.加7ml乙醇,置冰水浴中沉淀10分鐘。

5.4℃,12 000g離心10分鐘。

6.倒除乙醇,重懸DNA于500μl TE緩沖液中,重懸過(guò)程在4℃中需數(shù)小時(shí)。

7.為獲得大小合適的DNA片段,將步驟6中的DNA分作6分(每分約80μl),分別放在含蔗糖梯度密度Beckman Ultra-clear SW41超離心管中,各通過(guò)蔗糖梯度密度儀。在含10~40%的蔗糖,20 mM Tris(pH7.4),10mM EDTA,1M NaCl等濃度中形成線性梯度。

8.135 000g 20℃離心16小時(shí)。


次日

9.用粗針頭在每一管的底部刺一小孔(依次收集6管中的DNA)每管按12滴(350~500μl)作為一分收集入a, b, c…數(shù)管中,然后再收集第二管、第三管等依次并入a, b, c各管中。

10. 從每分中都取10μl樣品加10μl水稀釋、4μl載樣緩沖液、用0.4%瓊脂糖凝膠電泳,然后與Hind Ⅲ酶切的λDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作比較,以確定那一分中所含片段為10~20kb大小。

11. 將含有16~20kb片段的管子并在一起,加2.5倍體積的乙醇,-20℃冷凍數(shù)小時(shí)。


第三天

12.10 000g 4℃離心10分鐘,收集DNA。

13.棄上清液,重懸于160μl TE緩沖液中。

14.對(duì)大小合適的片段(16~20kb)再按8~13重復(fù)梯度分離,但此次只用兩個(gè)管子即可;每管中各用80μl DNA。第二次蔗糖梯度分離后,將沉淀的DNA懸浮在50μl TE緩沖液中。


第四天

15.取2.5μl樣品(用溴化乙錠染色),與已知濃度和片段大小的DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳后,比較兩者染色強(qiáng)度,估算出DNA濃度,并確證所制備出插入片段的不同大小。

16.把樣品DNA濃度調(diào)到0.25μl/ml,-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>


二)用于基因克隆載體DNA(噬菌體DNA)的制備

1. 用BamH I酶切EMBL3 DNA,加:

EBML3 DNA(500μg) 500μl

10×BamH I緩沖液 100μl

BamH I (10U/μl) 100μl

H2O 300μl

2. 于37℃保溫2小時(shí)。

3. 每管中加1體積(500μl)SS-酚和氯仿(1:1)混合物。充分混勻,于微型離心機(jī)中離心2分鐘以分離兩相,吸取上清水相至新管。

4. 在每管中加500μl氯仿,充分混勻,離心2分鐘,分相。

5. 吸水相轉(zhuǎn)入新管。

6. 在各試管中加50μl 5M NaCl,再加1ml乙醇。冰水浴中冷卻10分鐘。

7. 在微型離心機(jī)中4℃離心5分鐘。

8. 棄去上清液,加1ml 80%乙醇洗滌沉淀物,離心棄去液體。

9. DNA沉淀物真空干燥。

10. 用500μl TE緩沖液溶解沉淀物。

11. EcoR I酶切EBML3 DNA,加:

從步驟10中所獲DNA 500μl

10×EcoR I緩沖液 100μl

EcoR I (1 000U) 100μl

H2O 300μl

12. 于37℃保溫4小時(shí)。

13. 按3-9抽提、沉淀并回收。

14. 用500μl TE緩沖液溶解沉淀物。

15. 異丙醇沉淀:在步驟14中得到的500μl DNA于1.5ml離心管中加:3M 醋酸鈉(pH6.0)75μl,異丙醇(在1.5ml微型離心管中)300μl。

16. 冰水浴中置15分鐘。

17. 在微型離心機(jī)中4℃離心10分鐘。

18. 棄上清液,用200μl 0.35M醋酸鈉和乙醇(1:2.5)溶液洗滌沉淀物。

19. 在微型離心機(jī)中4℃離心10分鐘。

20. 重復(fù)步驟18和19。

21. 棄去上清液,真空干燥沉淀物。

22. 以0.5μg/μl濃度溶解于TE緩沖液中。

23. -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>


三)基因組DNA和載體噬菌體DNA的連接和包裝

1.可按下列步驟在5個(gè)1.5ml的小離心管中(用筆標(biāo)記上從A到E)加入下列試劑:10×連接酶緩沖液1.0μl,載體臂DNA(0.5μg/μl)2.0μl。

2.再往每管中加:


 A
 B
 C
 D
 E
 
Mbo I插入片段(0.25μg/μl)
 -
 1μl
 2μl
 3μl
 4μl
 
H2O
 6μl
 5μl
 4μl
 3μl
 2μl
 
T4 DNA連接酶
 1μl
 1μl
 1μl
 1μl
 1μl
 
每管總量10μl
 
 
 
 
 
 


3. 令其充分混合,離心,于14℃保溫12~16小時(shí),連接物可在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

4. 包裝方法:為簡(jiǎn)便起見(jiàn),可購(gòu)買(mǎi)包裝抽提物。各管子中的10μl連接液都用于包裝,按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。包括將連接物和包裝抽提液混合,然后22℃保溫2小時(shí)。

5. 包裝混合液用TMG緩沖液稀釋至250μl,包裝后的DNA于4℃保存,切勿冷凍。

6. 取等分稀釋液,倒平板,確定建庫(kù)的最適比例;然后按最適比例一系列連接和包裝反應(yīng),再合并。構(gòu)建文庫(kù)要測(cè)效價(jià)和倒平板,以便供篩選和擴(kuò)增之用。


四) 測(cè)效價(jià)和制備文庫(kù)平板

1.取500ml消毒培養(yǎng)瓶,注入100ml消毒LB培養(yǎng)液,再接種入2ml含有新鮮LE392細(xì)菌的麥芽糖液,培養(yǎng)至OD600近1.0。

2.收集細(xì)胞分別于兩個(gè)帶螺旋帽50ml聚苯乙烯管中;2500g離心10分鐘。

3.棄上清,把每一沉淀物重懸入25ml消毒的10mM MgSO4中。

4.LE392細(xì)胞在4℃中可存兩周;貯存過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低接種存活率。

5.接種噬菌體和測(cè)效價(jià):從每250μl包裝反應(yīng)液中取1μl(從前(三)中5),加入到99μl TMG中,分1μl和10μl此稀釋液加入13mm(直徑)×100mm(長(zhǎng))消毒管中;同時(shí)也稀釋和鋪制克隆載體平板、連接和包裝,但無(wú)插入(三種A管),作為本底對(duì)照。

6.從4步驟向每管中加200μl LE392細(xì)菌,混勻,室溫孵育20分鐘。

7.加2.5ml含有10 mM MgSO4的上層瓊脂(48℃);在室溫中把每管立即倒入瓊脂平板上,旋動(dòng),令上層瓊質(zhì)分散均勻。

8.室溫中置5分鐘,令瓊脂變硬,反置平板,37℃中培養(yǎng)8~16小時(shí),當(dāng)LE392細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后,由于溶菌作用,空斑形成將非常明顯。

9.計(jì)算每一包裝反應(yīng)效價(jià),統(tǒng)計(jì)每一平板空斑數(shù),理想濃度的插入片段的效價(jià)應(yīng)是:如建立文庫(kù)成功,與無(wú)插入對(duì)照文庫(kù)相比,至少大5~10倍。

10. 放大:如需放大,應(yīng)用足夠反應(yīng)樣品去建庫(kù),在最適條件下重復(fù)連接和包裝反應(yīng),但不擴(kuò)大反應(yīng)規(guī)模;對(duì)哺乳動(dòng)物基因組,理想的目標(biāo)文庫(kù)大小是1~2×106噬菌斑,合并包裝混合物,并通過(guò)倒平板計(jì)算噬菌斑數(shù),用來(lái)測(cè)定其效價(jià),或文庫(kù)的含量。

11. 以下7個(gè)步驟是倒平板供文庫(kù)篩選,如果篩選前要擴(kuò)增文庫(kù),則可按六、文庫(kù)擴(kuò)增法進(jìn)行,然后再回到步驟12。

12. 文庫(kù)倒平板篩選:要篩選5×105~106噬菌斑,一般每個(gè)90mm LB瓊脂平板上有104噬菌體;先取20ml LE392細(xì)胞;裝入50ml無(wú)菌帶帽塑料試管中,在細(xì)菌中加入已知效價(jià)的包裝混合液5×105~106噬菌斑,混合。

13. 室溫中置20分鐘,令噬菌體附到細(xì)胞上。

14. 在50~100個(gè)13×100mm的無(wú)菌玻璃試管中各加200μl受吸附的細(xì)菌。

15. 室溫下每管各加2.5ml 48℃融化的無(wú)菌LB上層瓊脂糖,并立即倒在LB瓊脂平板上,搖動(dòng)使之分布均勻,連續(xù)倒完全部平板。

16. 室溫下置15分鐘,使上層瓊脂糖凝固,于37℃倒置培養(yǎng)8~16小時(shí)。

17. 此間將出現(xiàn)噬菌斑。

18. 4℃保存平板。


五) 用放射性探針篩選已倒平板的文庫(kù)

1. 將瓊脂平板翻轉(zhuǎn),令瓊脂面下,去掉培養(yǎng)皿蓋,在室溫中空氣干燥30分鐘。

1.給每個(gè)培養(yǎng)皿編號(hào),用筆在對(duì)應(yīng)的NC濾膜上編號(hào)。

2.把濾膜小心地鋪在瓊脂平板上,編號(hào)朝上,濾膜0.5~1分鐘內(nèi)變濕,持續(xù)20分鐘使噬菌斑吸附到NC濾膜上。

3.用一根干凈的18號(hào)針頭穿過(guò)濾膜和瓊脂糖,戳5~10個(gè)孔,使濾膜在瓊脂糖膜上定位(此步很重要)。

4.用扁鉗小心緩慢從平板上揭下濾膜,注意不要掀起含噬菌體的瓊脂糖層,用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記針孔。

5.令號(hào)碼面朝下,在室溫中置30分鐘讓濾膜干燥,每個(gè)平板可再影印第2張濾膜,此對(duì)消除假陽(yáng)性信號(hào)很有用,因所有的真陽(yáng)性應(yīng)在兩張膜的同一位置上雜交,另外,第二張濾膜也可用第二種探針雜交。

6.將濾膜相繼浸入100ml下列3種溶液中(30~60秒/每次):

a. 0.2M NaOH,1.5M NaCl

b. 2×SSC,0.4M Tris pH7.4

c. 2×SSC

每浸潤(rùn)25張濾膜后更換一次溶液

7.硝酸纖維素膜面朝上,放置在Whatman 3mm紙上,室溫種干燥1小時(shí)。

8.80℃真空干燥2小時(shí)。

9. 用雜交緩沖液濕潤(rùn)所有濾膜,切口平移的探針用緩沖液-N,合成探針用緩沖液-S。

10. 在1只1L燒杯中,放入濾膜和足夠量的雜交緩沖液,浸泡濾膜。

11. 準(zhǔn)備雜交探針:將比活性為108cmp/μg的切口平移探針0.25μg加到1個(gè)帶螺紋帽的50ml試管中,加0.5ml 2mg/ml的鮭魚(yú)精子DNA溶液,再依次加入下列溶液并振蕩混合使其變形:10M NaOH 50μl; 2M Tris pH7.4 300μl; 1M HCl(延壁加)500μl。

12. 將此變性的探針加到放有濾膜和緩沖液的燒杯中,旋轉(zhuǎn)均勻。

13. 于42℃振蕩(輕輕搖動(dòng))4~16小時(shí),使切口平移探針雜交(合成探針的保溫溫度不同)。

14. 倒出燒杯中的雜交緩沖液,用500ml含0.1%SDS(W/V)2×SSC溶液在室溫中搖動(dòng)15分鐘。

15. 按步驟15再洗兩次,低鹽洗滌前用吸水紙吸干所有濾膜。

16. 用含0.1%SDS(W/V)0.1×SSC 500ml,52℃洗滌濾膜兩次,每次15分鐘。

17. 倒去洗滌緩沖液,用Whatman 3mm濾紙吸干濾膜,在空氣中干燥1小時(shí)。

18. 將NC濾膜貼在3mm濾紙上,用放射性墨水標(biāo)記3mm濾值;濾膜用干凈塑料紙包好,用增強(qiáng)屏在XAR-5底片下于-70℃曝光過(guò)夜,檢測(cè)陽(yáng)性信號(hào)。


第二次篩選

19. 將200μl LE392指示菌加到13×100mm試管中。加2.5ml含10mM MgSO4的48℃ LB上層瓊脂,室溫下立即倒入90mm的LB瓊脂板上,靜止5分鐘使之凝固,形成細(xì)菌苔,在培養(yǎng)皿底劃50個(gè)格子,供第二次噬菌體的生長(zhǎng)。

20. 按照膜上放射性墨水標(biāo)記與X光底片對(duì)齊,用標(biāo)記筆將膜上的位置孔標(biāo)記在底片上,用透射光幫助對(duì)齊。

21. 根據(jù)放射自顯影信號(hào),用牙簽挑取陽(yáng)性噬菌體斑或其附近噬菌體。

22. 將牙簽上噬菌體斑,點(diǎn)在各個(gè)菌苔方格里,只要將牙簽尖在菌苔上輕輕觸一下即可。

23. 倒置平板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

24. 加蓋NC濾膜,篩選,按步驟1-19進(jìn)行。


第三次篩選

25. 用牙簽轉(zhuǎn)移來(lái)自每一個(gè)原始陽(yáng)性信號(hào)的第二輪單個(gè)雜交噬菌斑中的噬菌體,每個(gè)牙簽可轉(zhuǎn)移106~107個(gè)噬菌體顆粒。

26. 將牙簽放進(jìn)盛有10ml無(wú)菌TMG緩沖液的無(wú)菌管中,劇烈振蕩混合,以混勻噬菌體。

27. 將步驟27的TMG混合液0.25μl和2.5μl放入兩個(gè)含有200μl LE 392倒平板細(xì)胞的13×100mm管子內(nèi),加2.5ml 48℃含10mM MgSO4的LB上層瓊脂,室溫下立即倒在90mm的LB瓊脂板上,搖動(dòng)使之分布均勻,室溫下凝固15分鐘。

28. 倒置平板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜,每個(gè)平板應(yīng)形成50~500個(gè)噬菌斑。

29. 用干凈牙簽從100~200個(gè)單獨(dú)分開(kāi)的噬菌斑中,把噬菌體轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)有LE392菌苔的平板上。

30. 倒置平板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

31. 按步驟1-19對(duì)格子里的噬菌體作第三次雜交和篩選。陽(yáng)性信號(hào)為純化的噬菌斑克隆,每一個(gè)來(lái)自初始陽(yáng)性信號(hào)的“戰(zhàn)勝者”,按步驟26用牙簽轉(zhuǎn)移到5ml TMG液。

32. 加1μl TMG混合液到200μl LE392到平板細(xì)胞中,按步驟28和29進(jìn)行,37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

33. 此平板上所有的噬菌斑,都是該克隆的純化噬菌斑,這平板可用Parafilm封柱,貯于4℃中,作為克隆的原種。平板上的單個(gè)噬菌斑,可直接用于這種噬菌體生長(zhǎng)的制備。


六)文庫(kù)擴(kuò)增

1.每2×104文庫(kù)中的噬菌體在一個(gè)無(wú)菌的13×100mm試管中同200μl LE392細(xì)胞混合。一般說(shuō),擴(kuò)增2×106個(gè)噬菌斑的文庫(kù)需100個(gè)試管,室溫下吸附培養(yǎng)20分鐘。

2.在每個(gè)試管中加入含10mM MgSO4 48℃的軟瓊脂2.5ml室溫下立即倒在90mm的LB瓊脂板上,搖動(dòng)鋪勻,不要倒轉(zhuǎn)平板,否則瓊脂會(huì)滑到一邊,37℃培養(yǎng)6~10小時(shí)。

3.當(dāng)噬菌體開(kāi)始形成針尖狀噬菌體斑,而尚未變大連接成片時(shí),加2ml LB培養(yǎng)液,用無(wú)菌塑料棒或彎曲的移液玻璃管從平板上刮下軟瓊脂,裝入一個(gè)無(wú)菌的1L燒杯中,每100ml體積平板上刮下的軟瓊脂中加2ml氯仿。

4.在一末端為圓錐形的無(wú)菌離心管中,3000g離心混合物10分鐘,瓊脂和細(xì)菌碎片將在管底形成沉淀,輕輕倒出含有擴(kuò)增文庫(kù)的上清液。

5.測(cè)定文庫(kù)體積:加NaCl晶體至種濃度為1M。

6.稀釋和倒平板,以測(cè)定擴(kuò)增文庫(kù)效價(jià),標(biāo)準(zhǔn)的效價(jià)為每1ml 5×109~1010個(gè)噬菌體。

7.將文庫(kù)分裝在1ml無(wú)菌管中,每管加3滴氯仿,4℃貯存。

8.在倒平板和篩選前再測(cè)定文庫(kù)效價(jià)。

 

 

 
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