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基因芯片的應(yīng)用

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

(一)基因表達(dá)分析 基因芯片具有高度的敏感性和特異性,它可以監(jiān)測細(xì)胞中幾個(gè)至幾千個(gè)mRNA拷貝的轉(zhuǎn)錄情況。與用單探針分析mRNA的點(diǎn)雜交技術(shù)不同,基因芯片表達(dá)探針陣列應(yīng)用了大約20對寡核苷酸探針來監(jiān)測每一個(gè)mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。每對探針中,包含一個(gè)與所要監(jiān)測的mRNA完全吻合和一個(gè)不完全吻合的探針(圖2),這兩個(gè)探針的差別在于其中間位置的核苷酸不同。這種成對的探針可以將非特異性雜交和背景訊號減小到最低的水平,由此我們就可以確定那些低強(qiáng)度的mRNA。目前,Affymetrix公司已經(jīng)生產(chǎn)出HugeneFL、Mu6500(含有小鼠6 500個(gè)基因)、Ye6100(含有酵母6 100個(gè)基因)等基因芯片成品。

1 分析基因表達(dá)時(shí)空特征。英國劍橋大學(xué)Whitehead研究所的Frank C.P. Holstege等人,應(yīng)用含有酵母基因組的基因芯片,深入研究了真核細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)周期。應(yīng)用基因組水平的表達(dá)分析,監(jiān)測那些表達(dá)受轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制的關(guān)鍵成分控制的基因,發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶II、主要的轉(zhuǎn)錄因子TFIID和SAGA染色體修飾復(fù)合物等均在基因的表達(dá)中有自己特定的作用位點(diǎn)[15]。通過本試驗(yàn),研究人員揭示了:(1)基因特異性的轉(zhuǎn)錄因子對表達(dá)的調(diào)控作用。(2)細(xì)胞在缺乏營養(yǎng)的環(huán)境中,基因不同位點(diǎn)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用的全新機(jī)制。(3)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最終作用位點(diǎn),在最初的幾步中就可以確定。以此試驗(yàn)為基礎(chǔ),研究人員進(jìn)一步繪制出了酵母基因組控制圖,并由此分析出了各種調(diào)節(jié)因子在基因上不同的作用位點(diǎn)和其作用的分子機(jī)制。
  美國Stanford大學(xué)的V.R.Iyer等人[16],對成纖維細(xì)胞中與細(xì)胞增生和損傷修復(fù)有關(guān)的基因進(jìn)行了分析。首先,他們用成纖維細(xì)胞中的8 600個(gè)基因片斷制成基因芯片的探針陣列,通過與mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA的雜交反應(yīng),可以判斷出該基因的活性。在試驗(yàn)中,成纖維細(xì)胞被置于無營養(yǎng)的環(huán)境中,使絕大部分基因的活性關(guān)閉,兩天后,加入10%的血清,24小時(shí)內(nèi),分6個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn),觀察基因的活化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明,在所有被監(jiān)測的基因中,約有500個(gè)基因最為活躍,而使細(xì)胞保持不分裂狀態(tài)的基因活性被抑制。其中,最早被活化的是那些轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。在活化的基因中,有28個(gè)基因共同作用,控制細(xì)胞的增殖;8個(gè)與免疫反應(yīng)的激活有關(guān);19個(gè)與血管重建有關(guān);另有許多基因,與血管新生密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中,基因的表達(dá)與正常的細(xì)胞存在著明顯的差異。通過基因芯片繪出基因表達(dá)的時(shí)空圖譜,有助于人類認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過程和特征。

2 基因差異表達(dá)檢測〔17〕 生命活動(dòng)中基因表達(dá)的改變是生物學(xué)研究的核心問題。理解人類基因組中10萬個(gè)不同的基因功能,監(jiān)測某些組織、細(xì)胞不同分化階段的差異基因表達(dá)(differential gene expression ,DGE)十分重要。對差異表達(dá)的研究,可以推斷基因與基因的相互關(guān)系,細(xì)胞分化中基因“開啟”或“關(guān)閉”的機(jī)制;揭示基因與疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的內(nèi)在聯(lián)系。目前DGE研究方法主要有表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)測序、差減克。╯ubtractive cloning )、差異顯示(differential display)、基因表達(dá)系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)。而cDNA微陣列雜交技術(shù)可監(jiān)測大量mRNA的轉(zhuǎn)錄,直接快速地檢測出極其微量的mRNA,且易于同時(shí)監(jiān)測成千上萬的基因,是研究基因功能的重要手段之一。Rihn BH等利用基因芯片檢測胸膜間皮瘤與正常細(xì)胞間比較了6500個(gè)基因,,發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)差異基因的表達(dá)。其中幾個(gè)典型基因的表達(dá)經(jīng)RT-PCR進(jìn)行定量后,可作為胸膜間皮瘤診斷的標(biāo)記物(Markers)[18]。Sgroi〔19〕報(bào)告DNA芯片結(jié)合激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection)用于乳癌浸潤期和轉(zhuǎn)移期及正常細(xì)胞的基因表達(dá)譜(gene expression profiles)差異研究,結(jié)果被定量PCR和免疫組化所證實(shí)。差異表達(dá)有助于早期發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞3萬個(gè)基因與正常細(xì)胞的區(qū)別,有助于了解瘤細(xì)胞的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和藥敏。最近,美國毒物化學(xué)研究所(CIIT) 和國家環(huán)境健康科學(xué)研究所(NIEHS)正計(jì)劃在一張玻片上建立8 700個(gè)小白鼠cDNA芯片,用于肝癌的研究。我國也已成功研制出能檢出41 000種基因表達(dá)譜的芯片。美國Stanford大學(xué)的David Botstein利用cDNA微陣列芯片,對乳腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞。利用基因芯片對表達(dá)進(jìn)行分析,在一次試驗(yàn)中可以獲取相當(dāng)于在60余萬次傳統(tǒng)的Northern雜交中所獲得的關(guān)于基因表達(dá)的信息。通過這種實(shí)驗(yàn)方法,可以建立一種全新的腫瘤分類學(xué)方法,即依據(jù)每個(gè)腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)情況對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分類。基因芯片技術(shù)在分析基因的表達(dá)中具有不可比擬的優(yōu)勢。
3 發(fā)現(xiàn)新基因 Moch等利用腫瘤微陣列芯片(5 184個(gè)cDNA片段)發(fā)現(xiàn)了腎細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物基因,并于正常細(xì)胞進(jìn)行比較。在532份標(biāo)本中檢測到胞漿纖維Vimentin的表達(dá)基因,陽性率為51%~61%〔20〕。追蹤觀察,有Vimentin表達(dá)的患者,預(yù)后極差。人類大量ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源,數(shù)據(jù)庫中400 000個(gè)ESTs代表了所有人類基因,成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析〔21〕。

定量檢測大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶等方面是很有價(jià)值的。如該技術(shù)在炎癥性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎癥性腸。↖BD)的基因表達(dá)研究中,由RA或IBD組織制備探針,用Cy3和Cy5熒光素標(biāo)記,然后與靶cDNA微陣列雜交,可檢測出炎癥疾病誘導(dǎo)的基因如TNF-α、IL或粒細(xì)胞集落刺激因子,同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如HME基因和黑色素瘤生長刺激因子。Schena等人[22]報(bào)道了cDNA的微陣列在人類基因表達(dá)監(jiān)測、生物學(xué)功能研究和基因發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用。采用含1,046個(gè)已知序列的cDNA微陣列,用高速機(jī)器人噴印在玻片上,用雙色雜交法定量監(jiān)測不同基因表達(dá),在一定的實(shí)驗(yàn)條件下,不同表達(dá)模式的陣列成分通過序列分析鑒定其特征。該方法較以往常用的方法敏感10倍以上,檢測限度為1:500,000(wt/wt)總?cè)梭wmRNA。在培養(yǎng)T細(xì)胞熱休克反應(yīng)的測定中,發(fā)現(xiàn)17個(gè)陣列成分的熒光比較明顯改變,其中11個(gè)受熱休克處理的誘導(dǎo),6個(gè)呈現(xiàn)中度抑制,對相應(yīng)于17個(gè)陣列成分的cDNA測序發(fā)現(xiàn)5個(gè)表達(dá)最高的成分是5種熱休克蛋白,17個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn)3個(gè)新序列。另外,在佛波酯誘導(dǎo)檢測中[23],發(fā)現(xiàn)有6個(gè)陣列成分信號增強(qiáng)超過2倍,測序及數(shù)據(jù)庫比較揭示有5個(gè)已知的,誘導(dǎo)表達(dá)最高的兩個(gè)是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-κB1,有一個(gè)是未知的。這4個(gè)新基因的表達(dá)水平均相對較低,僅呈現(xiàn)2倍的誘導(dǎo)。Northern雜交結(jié)果證實(shí)了微陣列的結(jié)果。進(jìn)一步檢測了人的骨髓、腦、前列腺及心臟組織中熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá),4種組織中檢測出15種熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá),其表達(dá)水平與Jurkat細(xì)胞中相應(yīng)成分的表達(dá)水平密切相關(guān)如在四種組織中表達(dá)水平最高的兩個(gè)基因β-actin和細(xì)胞色素C氧化酶在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)水平也很高。上述實(shí)驗(yàn)提示在缺乏任何序列信息的條件下,微陣列可用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)檢測。目前,大量人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源,數(shù)據(jù)庫中400,000個(gè)ESTs代表了所有人類基因,成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。
4 大規(guī)模DNA測序 人類基因組計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效的、自動(dòng)化操作的測序方法的發(fā)展。芯片技術(shù)中雜交測序(sequencing by hybridization, SBH)技術(shù)及鄰堆雜交(contiguous stacking hybridization, CSH)技術(shù)即是一種新的高效快速測序方法[24-26]。用含65 536個(gè)8聚寡核苷酸的微陣列,采用SBH技術(shù),可測定200 bp長DNA序列,采用67 108 864個(gè)13聚寡核苷酸的微陣列,可對數(shù)千個(gè)堿基長的DNA測序。SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加而提高,但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性,降低了雜交準(zhǔn)確性。CSH技術(shù)彌補(bǔ)了SBH技術(shù)存在的弊端,CSH技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長度,加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性,可進(jìn)行較長的DNA測序。計(jì)算機(jī)模擬論證了8聚寡核苷酸微陣列與5聚寡核苷酸鄰堆雜交,相當(dāng)于13聚寡核苷酸微陣列的作用,可測定數(shù)千個(gè)核苷酸長的DNA序列[26]。Dubiley等人[26]將合成的10聚寡核苷酸固定于排列在載片表面的0.1×0.1×0.02mm或1×1×0.02mm聚丙酰胺凝膠墊上制備聚寡核苷酸微陣列,先用分離微陣列(fractionation chips)進(jìn)行單鏈DNA分離,再用測序微陣列(sequencing chips)分析序列,后者聯(lián)合采用了10聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、DNA雜交及與鄰堆的5聚寡核苷酸連接等技術(shù)。該方法可用于含重復(fù)序列及較長序列的DNA序列測定及不同基因組同源區(qū)域的序列比較。利用基因芯片測序的準(zhǔn)確率達(dá)99%以上。

正如NIH首腦Harold Varmus在美國細(xì)胞生物學(xué)1998年年會(huì)上所說:“在基因芯片的幫助下,我們將能夠監(jiān)測一個(gè)細(xì)胞乃至整個(gè)組織中所有基因的行為。”

(二)基因型、基因突變和多態(tài)性分析 

在同一物種不同種群和個(gè)體之間,有著多種不同的基因型,而這種不同,往往與個(gè)體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關(guān)系。通過對大量具有不同性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比較,就可以得出基因與性狀的關(guān)系。但是,由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個(gè)基因同時(shí)決定的,因此分析起來就十分困難,然而基因芯片技術(shù)恰恰解決了這一問題,利用其可以同時(shí)反應(yīng)數(shù)千甚至更多個(gè)基因的特性,我們就可以分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān)系。美國Stanford大學(xué)的E.A.Winzeler等[27],以兩種不同菌株的酵母(S96和YJM789)作為實(shí)驗(yàn)材料,對控制酵母對放線菌酮的抗藥性的基因進(jìn)行分析。將含有酵母150 000個(gè)DNA片斷的基因芯片分別與這兩株酵母活化轉(zhuǎn)錄的mRNA分子雜交,S96幾乎全部吻合,而YJM789與芯片上的探針組存在較大的差異,約有3000個(gè)位點(diǎn)沒有雜交顯色。由于S96對放線菌酮有抗藥性而YJM789的抗藥性則弱的多,因此可以判定控制這一抗藥性的基因的所在。而后,通過對S96和YJM789雜交后產(chǎn)生的抗藥子代的遺傳標(biāo)記的分析,進(jìn)一步確定,控制該抗藥性的基因位于15號染色體,是一長約57 000個(gè)堿基的片斷。美國國家人類基因組研究室的J.G.Hacia等在Fodor研究小組的協(xié)助下[28],將基因芯片應(yīng)用于雙色突變分析。他們的分析對象是與人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關(guān)的BRCA1基因的外顯子11。在擴(kuò)增后,將BRCA1基因的外顯子11置于含有熒光素-12-UTP的環(huán)境中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng),而后將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA與BRCA1外顯子11芯片雜交,4小時(shí)后,用藻紅蛋白染色。在觀察時(shí),用488nm的氬離子激光進(jìn)行掃描,熒光染色位點(diǎn)呈現(xiàn)綠色,而藻紅蛋白染色的位點(diǎn)呈現(xiàn)紅色。應(yīng)用雙色分析,可以更為清楚的監(jiān)測未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)鏈之間的競爭性雜交情況,進(jìn)而分析該基因中的不同突變。通過對15名患者BRCA1基因的觀察,有14名患者在外顯子11位點(diǎn)存在不同的突變。Hacia等[29]在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104個(gè)長度為20 nt的寡核苷酸探針,用于檢測乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的堿基置換、插入和缺失(1~5 bp)突變。針對每一個(gè)位點(diǎn),共有28個(gè)獨(dú)立的探針,14個(gè)針對有義鏈,14個(gè)針對反義鏈。14個(gè)探針包括2個(gè)野生型,3個(gè)堿基置換、4個(gè)插入突變、5個(gè)堿基缺失。在15例患者樣品中,發(fā)現(xiàn)有14例有基因突變,類型包括點(diǎn)突變、插入及缺失等;在20例對照樣品中均未檢出假陽性結(jié)果,結(jié)果表明DNA芯片技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地研究大量患者樣品中特定基因所有可能的雜合變。Cronin等[30]分別用兩種DNA芯片檢測囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)(CFTR)的突變,其中一個(gè)芯片包含1 480個(gè)探針,檢測了CFTR基因的第10和11外顯子的已知突變,包括缺失、插入和單堿基置換,并分析了10個(gè)未知樣品的CFTR基因,其結(jié)果與PCR-RELP的分析結(jié)果完全一致。

Guo等人[31]利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸(ASOs)微陣列建立了簡單快速的基因多態(tài)性分析方法。將ASOs共價(jià)固定于玻璃載片上,采用PCR擴(kuò)增基因組DNA,其一條引物用熒光素標(biāo)記,另一條引物用生物素標(biāo)記,分離兩條互補(bǔ)的DNA鏈,將熒光素標(biāo)記DNA鏈與微陣列雜交,通過熒光掃描檢測雜交模式,即可測定PCR產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性,該方法對人的酪氨酸酶基因等4個(gè)外顯子內(nèi)含有的5個(gè)單堿基突變進(jìn)行分析,結(jié)果顯示單堿基錯(cuò)配與完全匹配的雜交模式非常易于區(qū)別。這種方法可快速、定量地獲得基因信息。β-地中海貧血中變異的檢測也論證了該方法的有效性和可信性[32]。Lipshutz等人[33]采用含18,495個(gè)寡核苷酸探針的微陣列,對HIV-1基因組反轉(zhuǎn)錄酶基因(rt)及蛋白酶基因(pro)的高度多態(tài)性進(jìn)行了篩選。微陣列中內(nèi)部探針與靶序列的錯(cuò)配具有明顯的不穩(wěn)定性,據(jù)此可快速區(qū)別核酸靶的差異。例如檢測序列5'GTATCAGCATXGCCATCGTGC中X堿基的種類,可用下列4種探針3'AGTCGTAACGGTAGC,3'AGTCGTACCGGTAGC,3'AGTCGTAGCGGTAGC,3'AGTCGTATCGGTAGC。高密度探針陣列可檢則具有特征性的較長序列相關(guān)的多態(tài)性與變異。篩選1,000個(gè)核苷酸序列的變異與多態(tài)性需要4,000個(gè)探針。用100μm合成位點(diǎn),設(shè)計(jì)1.28cm2陣列,將有大約16,000個(gè)探針,能篩選4kb序列。HIV-1基因組中rt與pro在疾病過程中易于發(fā)生多種變異,這些變異將導(dǎo)致病毒對多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等出現(xiàn)明顯抗性,因此檢測和分析rt與pro的變異與多態(tài)性具有重要的臨床意義。隨著遺傳病與癌癥相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)數(shù)量的增加,變異與多態(tài)性分析將越來越重要。Chee等[34]用含有1.35×105個(gè)長度為25 nt的寡核苷酸探針,分析了16.6 kb的人類線粒體基因組DNA(mt DNA),共分析了10個(gè)樣本,檢測出了505個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),并在Leber′s遺傳性視神經(jīng)疾病患者的mt DNA中檢測出3個(gè)致病性突變位點(diǎn)。

隨著人類基因組計(jì)劃的逐步發(fā)展,研究人員分析出了越來越多的基因序列。下一步,就是要分析這些基因的多態(tài)性與生物功能和疾病的關(guān)系,而這需要對大量個(gè)體進(jìn)行分析。通過基因芯片SNP(單核苷酸多態(tài)性)定位試驗(yàn),可以確定基因多態(tài)性和疾病的關(guān)系,同時(shí)也可確定致病的機(jī)制和病人對治療的反應(yīng)等。同樣,對于許多與人類疾病密切相關(guān)的致病微生物,也可對其進(jìn)行基因型和多態(tài)性分析,1998年,法國T.Livache等[35]就成功的利用基因芯片技術(shù),對人血中的HCV病毒進(jìn)行了基因型分析。SNP基因芯片的成功將使臨床診斷上到一個(gè)新的臺(tái)階。

(三)疾病的診斷與治療 人類的疾病與遺傳基因密切相關(guān),基因芯片可以對遺傳信息進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析,因此它在疾病的分子診斷中的優(yōu)勢是不言而喻的,就臨床一種新的、強(qiáng)有力的分子工具[36]。基因芯片技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于感染性疾病、腫瘤和藥物代謝等方面的研究。
  1 遺傳病相關(guān)基因的定位 90年代以來,隨著人類基因組計(jì)劃的發(fā)展,各種方法被相繼創(chuàng)立并應(yīng)用到基因定位中。我國有4 000萬育齡婦女,每年有2 000萬新生兒,準(zhǔn)確檢測遺傳病基因是優(yōu)生優(yōu)育的技術(shù)保障。DNA芯片充分結(jié)合并靈活運(yùn)用了大規(guī)模集成電路制造技術(shù)、自動(dòng)化技術(shù)、計(jì)算機(jī)及網(wǎng)絡(luò)技術(shù)、激光共聚焦掃描、DNA合成、熒光標(biāo)記探針、分子雜交及分子生物學(xué)的其它技術(shù),在這一領(lǐng)域的研究中有著巨大的潛力。這一技術(shù)已成為基因定位研究的高效工具。隨著遺傳病與癌癥相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)數(shù)量的增加,變異與多態(tài)性分析將越來越重要。HGP使許多遺傳疾病基因得以定位,配合使用多位PCR (multiplex-PCR) /DNA芯片可一次篩查多種遺傳病,既經(jīng)濟(jì)快速又敏感可靠[37,38]。
2 腫瘤診斷 已用基因芯片檢測人鼻咽癌、肺癌基因表達(dá)譜、腫瘤原癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)和定位。早在1996年,M.J.Kozal等就利用基因芯片[39],對HIV-I B亞型中的蛋白酶基因的多態(tài)性進(jìn)行了分析,這也是基因芯片技術(shù)被首次應(yīng)用于臨床實(shí)踐。在艾滋病的治療中,使用HIV蛋白酶抑制劑是一種重要的手段。然而,病毒對該藥物的反應(yīng)卻有著很大的差異。利用基因芯片技術(shù),研究人員分析了取自102個(gè)病人的167個(gè)病毒單體,發(fā)現(xiàn)這些同為美國HIV-I B亞種的病毒的基因序列存在極大差異,其中蛋白酶的基因片斷差異最大,在編碼99個(gè)氨基酸的序列中,竟有47.5%存在明顯突變。這些氨基酸的突變,直接導(dǎo)致了病毒抗藥性的不同。含96 600個(gè)20體寡核苷酸高密度陣列對遺傳性乳腺和卵巢癌BRCA1基因3.45 kb的第11個(gè)外顯子進(jìn)行雜合變異篩選,15個(gè)患者的已知變異的樣品中,準(zhǔn)確診斷出14個(gè)患者,20個(gè)對照樣品中未發(fā)現(xiàn)假陽性。用Affimetrix p53芯片和PCR-SSCP調(diào)查42例有乳癌史的家系,p53基因13 964位的G變?yōu)镃,突變率為7.1%;無乳癌家族史者為0。Favis等用多位PCR/連接酶檢測反應(yīng)(PCR/LDR)在一個(gè)試管內(nèi)同時(shí)檢測數(shù)百個(gè)基因突變,用于檢測大腸癌組織k-ras 和p53突變及BRCA-1和BRCA-2低頻率突變收到良好效果。
人類惡性腫瘤中,約有60%與人類p53抑癌基因的突變有關(guān),目前研究人員已經(jīng)研制成功了可以檢測p53基因所有編碼區(qū)(外顯子2~外顯子11)錯(cuò)意突變和單堿基缺失突變的基因芯片。以外顯子7的第248個(gè)密碼子為例,野生型為CGG,在芯片上做出5條探針,相應(yīng)位點(diǎn)分別為GAC、GCC、GGC、GTC和G-C,根據(jù)雜交后的熒光顯色圖,就可以分析出該位點(diǎn)為何種突變。

3 感染性疾病的診斷 HIV-1基因組中rt與pro在疾病過程中易于發(fā)生多種變異,這些變異將導(dǎo)致病毒對多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等出現(xiàn)明顯抗性,因此檢測和分析rt與pro的變異與多態(tài)性具有重要的臨床意義。Hayward[40]以3 648個(gè)插入片段建立獵槍微陣列(shotgun microarray),通過差異雜交和DNA測序找到了瘧原蟲無性和有性生殖階段基因差異表達(dá),為抗瘧藥設(shè)計(jì)提供了線索。可以預(yù)測在不久的將來,人們可望在一張DNA芯片上檢測幾乎所有的病原微生物基因,實(shí)現(xiàn)真正意義上的“組合檢測(profile tests)”。
4 耐藥菌株和藥敏檢測 據(jù)WHO報(bào)告,全球每年約有800萬結(jié)核病患者,有300萬人死亡,死亡人數(shù)超過了艾滋病和瘧疾的總和。主要原因是菌株對不同的藥物產(chǎn)生了抗藥性(俄國80%TB對一種藥物產(chǎn)生抗性;美國50%為多重耐藥)。對每例患者進(jìn)行菌株和藥敏鑒定是控制TB的關(guān)鍵。最近,俄美兩國科學(xué)家開發(fā)了具此功能的基因芯片,可使醫(yī)生及早使用敏感藥物。該芯片(TB Biochips)將抗性菌株的單鏈DNA標(biāo)記后固定在玻片上,與待檢TB株雜交,臨床使用未見假陽性,該芯片可清洗后重復(fù)使用50次。
(四)藥物研究中的應(yīng)用

從經(jīng)濟(jì)效益來說,最大的應(yīng)用領(lǐng)域可能是制藥廠用來開發(fā)新藥。所以已經(jīng)有多家制藥企業(yè)介入芯片的開發(fā)。如: Incyte Pharmaaceuticals Inc.,Sequana Therapeutics,Millenium Pharmaceuticals Inc.等。對于尋找新藥來說,目標(biāo)之一是應(yīng)用芯片可以在基因水平上尋找藥物靶標(biāo)。采用所謂“譯碼器”策略(Decoder strategy)來確定藥物靶標(biāo)。從而找到“導(dǎo)向藥物”;蛐酒脖挥糜趯ふ业鞍准っ敢种莆铩<(xì)菌或腫瘤組織的耐藥性也涉及基因改變可以用DNA芯片鑒定。
1 新藥開發(fā) 高通量的DNA芯片可發(fā)現(xiàn)眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設(shè)計(jì)。噬菌體展示技術(shù)可創(chuàng)造大量蛋白質(zhì),目前多用于抗體庫的建立和篩選,進(jìn)而可用于受體-配體相互作用的研究;蚪M學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)(bioinformatics)將大大促進(jìn)制藥工業(yè)的發(fā)展。目前第一個(gè)生物分子工程藥物Herceptin已用于乳癌的治療,并獲得美國FDA的批準(zhǔn)。除腫瘤外,用分子生物工程設(shè)計(jì)的藥物可用于治療遺傳病及代謝疾病、抗衰老、設(shè)計(jì)新的抗生素和工業(yè)用酶等。

同時(shí),有時(shí)一種藥物的作用是多方面的,基因芯片有助于發(fā)現(xiàn)一種藥物的新的功能。原先設(shè)想的作用是針對某一靶標(biāo)的,但在全基因或廣范圍篩選中卻發(fā)現(xiàn)該藥在另一方面有很強(qiáng)的抑制作用,從而開發(fā)成另一種新藥。

2 調(diào)查藥物處理細(xì)胞后基因的表達(dá)情況
  基因芯片在用來研究藥物的作用機(jī)理時(shí)十分有用。Marton[40]等人利用基因芯片構(gòu)建了免疫抑制性藥物FK506處理酵母細(xì)胞后的基因表達(dá)圖譜。發(fā)現(xiàn)用FK506處理的酵母細(xì)胞基因表達(dá)圖譜與FK506靶標(biāo)的無意義突變體相似。而用FK506去處理此突變體,發(fā)現(xiàn)了不同于野生型的作用機(jī)制。Clarke等[41]用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表達(dá)增加。該研究提示,這類研究既有助于闡明藥物的作用機(jī)制,也有助于確定藥物作用的靶基因,為新藥研究提供線索。
3 對藥物進(jìn)行毒性評價(jià)
  應(yīng)用芯片查找藥物的毒性或副作用,進(jìn)行毒理學(xué)研究。尤其是慢性毒性和副作用,往往涉及基因或基因表達(dá)的改變。如果藥物能抑制重要基因的表達(dá),則對它的深入研究就值得考慮。用芯片作大規(guī)模的表達(dá)研究往往可省略大量的動(dòng)物試驗(yàn)。若某個(gè)正在篩選的潛在藥物作用靶細(xì)胞得到的基因表達(dá)圖譜與已知的具有毒性副作用的藥物得到的基因表達(dá)圖譜相似時(shí),就要考慮是否停止藥物開發(fā)(drug development)中花費(fèi)巨大的臨床實(shí)驗(yàn)階段。Nuwaysir等[42]研制了包括涉及細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制和修復(fù)、氧化應(yīng)激/氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)、過氧化物酶體增殖反應(yīng)、二?英/多環(huán)芳烴反應(yīng)、雌激素反應(yīng)、看家基因、癌基因和抑癌基因、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、受體、細(xì)胞色素P450等共2 090個(gè)基因的毒理芯片(ToxChip v1.0), 該芯片既可用于毒物的檢測和遺傳多態(tài)性的檢測,又可用于受檢毒物的毒作用機(jī)制的研究。最近,Holden等從人和小鼠文庫中選擇約600個(gè)與毒理學(xué)相關(guān)基因的cDNA克隆,制備了種屬特異的毒理基因組學(xué)芯片,可研究肝臟毒性、內(nèi)分泌干擾、致癌作用等毒性終點(diǎn)的作用機(jī)制,也可用于確定以基因表達(dá)模式為基礎(chǔ)的化合物的毒性。

(五)基因芯片中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

中醫(yī)學(xué)中應(yīng)用基因芯片技術(shù),還處于初始階段,目前主要集中以下三個(gè)方面:

1中藥的研究,具體的方法,同上述藥物篩選方法類似。尤其中藥中眾多成分中有效成分的篩選、有效藥物的篩選、中藥毒理學(xué)過程均被大大簡化,將推動(dòng)中藥的迅猛發(fā)展。中藥學(xué)引入基因芯片技術(shù),將大大推動(dòng)中藥研究的國際化進(jìn)程,為闡明中藥作用機(jī)理,具有無可估量的重要意義。

2中醫(yī)“證”本質(zhì)的研究。中醫(yī)“證”的中醫(yī)藥的臨床治療的核心,但“證”的本質(zhì)研究一直難以有重大進(jìn)展。主要因?yàn)橹嗅t(yī)理論設(shè)及到生命的整體,因而它牽涉到許多基因和蛋白質(zhì),傳統(tǒng)的方法學(xué)無法弄清“證”的實(shí)質(zhì),而利用基因芯片技術(shù),對不同“證”狀態(tài)的基因組進(jìn)行掃描,再繪出不同證的基因表達(dá)譜,通過相關(guān)分析,可望獲得一些有意義的成果。也是從分子基因水平全面揭示“證”本質(zhì)提供了可能。如果證本質(zhì)被揭示,它可能會(huì)引起醫(yī)學(xué)治療學(xué)理論的重大革新或變化,尤其是個(gè)體化治療方案可能重新被重視。

3針灸原理研究。針灸的原理設(shè)及全身各個(gè)部分,針灸不同方法、不同穴位、經(jīng)絡(luò)是否具有不同的作用,也即經(jīng)脈與臟腑間的相關(guān)聯(lián)系是否具有相對特異性。通過基因芯片測量不同組織基因表達(dá)的差異,判斷基因表達(dá)是否具有特異性,有望解決這一長期爭論不休的問題。如果心經(jīng)與心臟具有相對特異性,那么針刺心經(jīng)后,心臟內(nèi)可能會(huì)出現(xiàn)某些與針刺相關(guān)的特異性基因表達(dá),而且,這種表達(dá)只在針刺心經(jīng)時(shí)出現(xiàn),這些基因可能不在其它器官,如肝臟中表達(dá)。那么可以肯定地認(rèn)為經(jīng)脈臟腑相關(guān)是具有相對特異性的,也可以認(rèn)為傳統(tǒng)經(jīng)絡(luò)理論是有依據(jù)的。

另一方面,基因芯片還有助于揭示針灸的作用機(jī)制。針灸的作用是與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(NEI networks)密切相關(guān)的,它設(shè)及到細(xì)胞信使、神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)、神經(jīng)肽、細(xì)胞因子、內(nèi)分泌激素等多種因子,但針灸的信號是如何在細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)傳遞的過程仍不明朗,如果引入基因芯片,可以高通量的檢測細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的時(shí)空特征,有助于了解針灸促進(jìn)基因表達(dá)的特點(diǎn),進(jìn)而再利用蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù),揭示針灸作用原理。現(xiàn)在已有部分工作正在進(jìn)行。

(六)其它應(yīng)用

1環(huán)境化學(xué)毒物的篩選 我們的生活環(huán)境中存在著數(shù)千種化學(xué)物質(zhì),每種物質(zhì)在投入使用前必須進(jìn)行人體毒性試驗(yàn),傳統(tǒng)的動(dòng)物試驗(yàn)費(fèi)用高昂,且存在著國際上關(guān)注的動(dòng)物福利(animal welfare)問題。采用毒物檢測芯片(Toxchips)可對環(huán)境中眾多化學(xué)物質(zhì)對人類基因的潛在毒性進(jìn)行篩選,探查毒物“開啟”或“關(guān)閉”哪些基因,研究“環(huán)境如何改變我們的基因”。NIEHS將對人類100 000個(gè)基因中的12 000個(gè)基因進(jìn)行檢測,弄清致癌物質(zhì)對基因的改變,建立化學(xué)物質(zhì)指紋庫(fingerprints of chemicals),然后即可通過測定特定基因的突變與否判斷新的合成物質(zhì)的生物毒性。

2體質(zhì)醫(yī)學(xué)的研究。體質(zhì)醫(yī)學(xué)關(guān)系到個(gè)體化治療的核心問題,不同的人具有不同的體質(zhì)基礎(chǔ),其原因與基因型可能存在一定的相關(guān)性,尤其可能與SNP關(guān)系較大,如何全面了解人的SNP差異,以及它與體質(zhì)因素、疾病的易感性間關(guān)系,是值得研究的重大課題。

 

 

 
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