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聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡(jiǎn)稱PCR技術(shù),是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA片斷高效擴(kuò)增的技術(shù),可檢出微量靶序列(甚至少到1個(gè)拷貝)。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。僅需用極少量模板,在一對(duì)引物介導(dǎo)下,在數(shù)小時(shí) 內(nèi)可擴(kuò)增至100萬(wàn)-200萬(wàn)份拷貝。PCR反應(yīng)分三步:變性、退火及延伸。以上三步為一循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)的模板,這樣經(jīng)過(guò)九小時(shí)的循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板,這樣經(jīng)過(guò)數(shù)上時(shí)的循環(huán)后,可得到大量復(fù)制的特異性DNA片段。反應(yīng)條件一般為94℃變性30秒,55℃退火30秒,70-72℃延伸30-60秒,共進(jìn)行30次循環(huán)左右,最后再延伸72℃5分鐘,4℃冷卻終止反應(yīng)。

1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用來(lái)擴(kuò)增RNA的方法。

2.競(jìng)爭(zhēng)逆轉(zhuǎn)錄PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低豐度RNA定量的好方法。

3.多重PCR(multiples PCR)在同一PCR體系中加入多對(duì)引物可用于基天長(zhǎng)度很長(zhǎng),發(fā)生多處缺失的???

4.多種PCR可同時(shí)加入多套以生物素標(biāo)記的引物起進(jìn)手PCR反應(yīng)。

5.反向PCR(iverse polymerase chain reaction)對(duì)一個(gè)已知的DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。

6.不對(duì)稱PCR在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同引物濃度,以得到單鏈DNA并進(jìn)行列測(cè)定,以了解目的基因的序列。

7.錨定PCR(anchored polymerase chain reaction)幫助克服序列未知或序列未全知帶來(lái)的障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序,將互補(bǔ)的引物連接于一段帶限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的錨上,在錨引物和基因另一側(cè)特異性引物的作用下,將未知序列擴(kuò)增出來(lái)。

8.著色互補(bǔ)試驗(yàn)或熒光PCR(color complementation assay or fluorescent PCR)原理是用不同熒光染粒,分別標(biāo)記于不同寡核苷酸引物上,同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段,反應(yīng)完畢后,利用分子篩選去多余的引物。用紫外線照射擴(kuò)增產(chǎn)物,就能顯示某一DNA區(qū)帶熒光染料顏色的組合,如果某一DNA區(qū)帶熒光染色料顏色的組合,如果某一DNA區(qū)帶缺失,則會(huì)缺乏相應(yīng)的顏色。

9.雙溫PCR(two-temperature PCR)僅僅執(zhí)行兩步溫度程序。合并退火與延伸溫度。一般常用溫度是94-95℃和46-47℃?梢蕴岣叻磻(yīng)的速度和特異性。

上述這些PCR技術(shù)的應(yīng)用:(1)PCR技術(shù)擴(kuò)增特定序列為基礎(chǔ),采用多種方法進(jìn)行檢測(cè),如PCR-RFLP、PCR-SSCP從已克隆的雙鏈DNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針;(2)通過(guò)選擇性擴(kuò)增cDNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針;(2)通過(guò)選擇性擴(kuò)增cDNA中的特殊片段,產(chǎn)生針對(duì)尚未克隆的基因的探針;(3)從微量mRNA中產(chǎn)生cDNA文庫(kù);(4)產(chǎn)生大量用于序列分析的DNA;(5)分析 基因突變;(6)做染色體步移。
10.原位PCR技術(shù):PCR雖然能擴(kuò)增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的各種標(biāo)本的DNA,但擴(kuò)增的DNA或RNA產(chǎn)物不能在組織細(xì)胞中定位,因而不能直接與特定的組織細(xì)胞特征相聯(lián)系,這是該技術(shù)一個(gè)局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力,但由于其敏感性問(wèn)題,尤其是在石蠟切片中,尚不能檢測(cè)出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR(In situ PCR,簡(jiǎn)稱IS PCR),它可使擴(kuò)增的特定DNA片段在分離細(xì)胞和組織切片中定位,從而彌補(bǔ)了PCR和原位雜交的不足,具有良好的應(yīng)用前景。目前,已有多種設(shè)計(jì)的原位PCR擴(kuò)增儀系統(tǒng)問(wèn)世,使操作簡(jiǎn)便,軟件靈活,已成為拉增固定細(xì)胞和石蠟包埋組織中特定DNA和RNA序列的有用工具。

IS PCR的技術(shù)特點(diǎn)

(1)既具有PCR的特異性與高靈敏性,又具有原位雜交的定位準(zhǔn)確性;(2)測(cè)到低于2個(gè)拷貝量的細(xì)胞內(nèi)特定DNA序列,甚至可檢測(cè)出單一細(xì)胞中的僅含一個(gè)拷貝的原病毒DNA;(3)有助于細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學(xué)變化的結(jié)合分析;(4)可用于正;驉盒约(xì)胞,感染或非感染細(xì)胞的鑒定與區(qū)別。

IS PCR的基本方法

IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術(shù)的綾事,實(shí)質(zhì)是一種將靶DNA或RNA在原位擴(kuò)增后再進(jìn)行原位雜交的技術(shù),操作程序基本兼有兩種技術(shù)的所有過(guò)程,首先在適當(dāng)處理的細(xì)胞和組織切片上滴加PCR反應(yīng)液,然后把載玻片放入熱循環(huán)儀中進(jìn)行擴(kuò)增,最后通過(guò)標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

初步應(yīng)用

有關(guān)原位PCR技術(shù)應(yīng)用成功的第一篇報(bào)道是對(duì)感染綿羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)visna病毒在綿羊脈絡(luò)從一細(xì)胞中檢查,通過(guò)PCR擴(kuò)增,僅用150堿基對(duì)的短探針就可通過(guò)ISH檢查到了細(xì)胞內(nèi)的visna病毒。從開(kāi)始在試管內(nèi)細(xì)胞行PCR擴(kuò)增后再涂片做ISH(原位雜交)檢查,已發(fā)展到用福爾馬林固定、石蠟切片的常規(guī)病理組織方法做原位PCR檢查。有傳統(tǒng)的標(biāo)記探針的原位PCR法(間接法),也有將標(biāo)記物先標(biāo)記PCR的引物,讓標(biāo)記物擴(kuò)增后再行ISH檢查的直接法。因此,目前就原位PCR方法而言,尚未能獲得統(tǒng)一,也即未能比較出哪一種方法最可靠簡(jiǎn)便,各家報(bào)道的原位PCR技術(shù)中,在標(biāo)本處理和種類上尚不同(細(xì)胞懸液、涂片、組織切片等),想檢測(cè)的靶核酸也不同(病毒或體細(xì)胞的DNA或mRNA),擴(kuò)增的方法上有不同(單引物、多引物),最后顯示的方法也不同(直接法、間接法)。這些還都有待在今后的工作中積累經(jīng)驗(yàn),以求一致。

原位PCR應(yīng)用的課題,目前正片于開(kāi)始階段,還很局限,對(duì)人體B細(xì)胞淋巴瘤中Ig單拷貝基因重組的檢查以及對(duì)人體外周血中單核細(xì)胞HLA-DQ不同亞型的測(cè)定,歸納起來(lái),主要應(yīng)用于兩方面;(1)檢測(cè)外源懷基因片段,集中在病毒感染的檢查上,如HIV、HPV、HBV、CMV等;(2)內(nèi)源性基因片段,如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。

 

 

 
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