聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡(jiǎn)稱PCR技術(shù)，是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA片斷高效擴(kuò)增的技術(shù)，可檢出微量靶序列（甚至少到1個(gè)拷貝）。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。僅需用極少量模板，在一對(duì)引物介導(dǎo)下，在數(shù)小時(shí) 內(nèi)可擴(kuò)增至100萬(wàn)-200萬(wàn)份拷貝。PCR反應(yīng)分三步：變性、退火及延伸。以上三步為一循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)的模板，這樣經(jīng)過(guò)九小時(shí)的循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板，這樣經(jīng)過(guò)數(shù)上時(shí)的循環(huán)后，可得到大量復(fù)制的特異性DNA片段。反應(yīng)條件一般為94℃變性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共進(jìn)行30次循環(huán)左右，最后再延伸72℃5分鐘，4℃冷卻終止反應(yīng)。

1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用來(lái)擴(kuò)增RNA的方法。

2.競(jìng)爭(zhēng)逆轉(zhuǎn)錄PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低豐度RNA定量的好方法。

3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR體系中加入多對(duì)引物可用于基天長(zhǎng)度很長(zhǎng)，發(fā)生多處缺失的？？？

4.多種PCR可同時(shí)加入多套以生物素標(biāo)記的引物起進(jìn)手PCR反應(yīng)。

5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）對(duì)一個(gè)已知的DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。

6.不對(duì)稱PCR在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同引物濃度，以得到單鏈DNA并進(jìn)行列測(cè)定，以了解目的基因的序列。

7.錨定PCR（anchored polymerase chain reaction）幫助克服序列未知或序列未全知帶來(lái)的障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序，將互補(bǔ)的引物連接于一段帶限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的錨上，在錨引物和基因另一側(cè)特異性引物的作用下，將未知序列擴(kuò)增出來(lái)。

8.著色互補(bǔ)試驗(yàn)或熒光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同熒光染粒，分別標(biāo)記于不同寡核苷酸引物上，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段，反應(yīng)完畢后，利用分子篩選去多余的引物。用紫外線照射擴(kuò)增產(chǎn)物，就能顯示某一DNA區(qū)帶熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶熒光染色料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶缺失，則會(huì)缺乏相應(yīng)的顏色。

9.雙溫PCR（two-temperature PCR）僅僅執(zhí)行兩步溫度程序。合并退火與延伸溫度。一般常用溫度是94-95℃和46-47℃�？梢蕴岣叻磻�(yīng)的速度和特異性。

上述這些PCR技術(shù)的應(yīng)用：（1）PCR技術(shù)擴(kuò)增特定序列為基礎(chǔ)，采用多種方法進(jìn)行檢測(cè)，如PCR-RFLP、PCR-SSCP從已克隆的雙鏈DNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針；（2）通過(guò)選擇性擴(kuò)增cDNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針；（2）通過(guò)選擇性擴(kuò)增cDNA中的特殊片段，產(chǎn)生針對(duì)尚未克隆的基因的探針；（3）從微量mRNA中產(chǎn)生cDNA文庫(kù)；（4）產(chǎn)生大量用于序列分析的DNA；（5）分析 基因突變；（6）做染色體步移。
10.原位PCR技術(shù)：PCR雖然能擴(kuò)增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的各種標(biāo)本的DNA，但擴(kuò)增的DNA或RNA產(chǎn)物不能在組織細(xì)胞中定位，因而不能直接與特定的組織細(xì)胞特征相聯(lián)系，這是該技術(shù)一個(gè)局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力，但由于其敏感性問(wèn)題，尤其是在石蠟切片中，尚不能檢測(cè)出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR（In situ PCR,簡(jiǎn)稱IS PCR），它可使擴(kuò)增的特定DNA片段在分離細(xì)胞和組織切片中定位，從而彌補(bǔ)了PCR和原位雜交的不足，具有良好的應(yīng)用前景。目前，已有多種設(shè)計(jì)的原位PCR擴(kuò)增儀系統(tǒng)問(wèn)世，使操作簡(jiǎn)便，軟件靈活，已成為拉增固定細(xì)胞和石蠟包埋組織中特定DNA和RNA序列的有用工具。

IS PCR的技術(shù)特點(diǎn)

（1）既具有PCR的特異性與高靈敏性，又具有原位雜交的定位準(zhǔn)確性；（2）測(cè)到低于2個(gè)拷貝量的細(xì)胞內(nèi)特定DNA序列，甚至可檢測(cè)出單一細(xì)胞中的僅含一個(gè)拷貝的原病毒DNA；（3）有助于細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學(xué)變化的結(jié)合分析；（4）可用于正�；驉盒约�(xì)胞，感染或非感染細(xì)胞的鑒定與區(qū)別。

IS PCR的基本方法

IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術(shù)的綾事，實(shí)質(zhì)是一種將靶DNA或RNA在原位擴(kuò)增后再進(jìn)行原位雜交的技術(shù)，操作程序基本兼有兩種技術(shù)的所有過(guò)程，首先在適當(dāng)處理的細(xì)胞和組織切片上滴加PCR反應(yīng)液，然后把載玻片放入熱循環(huán)儀中進(jìn)行擴(kuò)增，最后通過(guò)標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

初步應(yīng)用

有關(guān)原位PCR技術(shù)應(yīng)用成功的第一篇報(bào)道是對(duì)感染綿羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)visna病毒在綿羊脈絡(luò)從一細(xì)胞中檢查，通過(guò)PCR擴(kuò)增，僅用150堿基對(duì)的短探針就可通過(guò)ISH檢查到了細(xì)胞內(nèi)的visna病毒。從開(kāi)始在試管內(nèi)細(xì)胞行PCR擴(kuò)增后再涂片做ISH(原位雜交)檢查，已發(fā)展到用福爾馬林固定、石蠟切片的常規(guī)病理組織方法做原位PCR檢查。有傳統(tǒng)的標(biāo)記探針的原位PCR法（間接法），也有將標(biāo)記物先標(biāo)記PCR的引物，讓標(biāo)記物擴(kuò)增后再行ISH檢查的直接法。因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能獲得統(tǒng)一，也即未能比較出哪一種方法最可靠簡(jiǎn)便，各家報(bào)道的原位PCR技術(shù)中，在標(biāo)本處理和種類上尚不同（細(xì)胞懸液、涂片、組織切片等），想檢測(cè)的靶核酸也不同（病毒或體細(xì)胞的DNA或mRNA），擴(kuò)增的方法上有不同（單引物、多引物），最后顯示的方法也不同（直接法、間接法）。這些還都有待在今后的工作中積累經(jīng)驗(yàn)，以求一致。

原位PCR應(yīng)用的課題，目前正片于開(kāi)始階段，還很局限，對(duì)人體B細(xì)胞淋巴瘤中Ig單拷貝基因重組的檢查以及對(duì)人體外周血中單核細(xì)胞HLA-DQ不同亞型的測(cè)定，歸納起來(lái)，主要應(yīng)用于兩方面；（1）檢測(cè)外源懷基因片段，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）內(nèi)源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。