(1) 根據(jù)雜交液的體積確定雜交的時間：一般來說使用較小體積的雜交液比較好，因為在小體積溶液中，核酸重新配對的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的DNA在反應(yīng)中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。
(2) 根據(jù)所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時,則在68℃雜交,而在50%甲酰胺溶液中時,則在42℃下雜交。
(3) 選用不同的封閉試劑：如Denhardt's試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO, 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。與Denhardt's試劑相比, BLOTTO價格便宜,使用方便,同樣可獲得滿意的結(jié)果，但它不能用于RNA雜交。一般而言,尼龍膜用Denhardt's試劑比用BLOTTO能得到更高的信噪比。對硝酸纖維素濾膜而言,通常在預(yù)雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。但是對尼龍膜，經(jīng)常從雜交溶液中省去封閉劑，因為高濃度的蛋白質(zhì)會干擾探針和目的基因的退火。
(4)根據(jù)需要在雜交過程中選用不同的振蕩方法和程度,許多雜交膜一起反應(yīng)時,連續(xù)的輕微振蕩可獲得較好的雜交結(jié)果。
(5) 在雜交過程中加入其他化合物, 如反應(yīng)體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 雜交速度可增加約10倍。檢測稀有序列時常用該方法，但它們有時會導(dǎo)致本底較高，并由于溶液的粘稠性而使操作困難。因此，除非在濾膜上含有的目的DNA量很少,或放射性探針的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。
(6) 根據(jù)探針與被檢測目標之間的同源程度選擇清洗的程度,如具有很高的同源性可選用嚴緊型洗脫方式（高濃度SSC）, 反之則選用非嚴緊型洗脫方式（低濃度SSC）。洗脫通常在低于雜交體解鏈溫度12-20℃的條件下進行。解鏈溫度(melting temperature, Tm )是指在雙鏈DNA或RNA分子變性形成分開的單鏈時光吸收度增加的中點處溫度。通常富含G·C堿基對的序列比富含A·T堿基對序列的Tm 溫度高。有關(guān)Tm的計算方法，請參考第八章。
(7) 根據(jù)標記探針的濃度及其比活性,選擇不同的雜交條件及檢測方法。一般使用新的同位素可獲得較強的信號。
(8) 在水溶液中雜交時,用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一樣。但在甲酰胺溶液中雜交時,應(yīng)該用具有更強緩沖能力的6×SSPE。
上述這些條件的改變，對雜交的結(jié)果有不同的影響，應(yīng)根據(jù)研究的具體情況，選用適當(dāng)?shù)姆椒ā?
(2) 根據(jù)所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時,則在68℃雜交,而在50%甲酰胺溶液中時,則在42℃下雜交。
(3) 選用不同的封閉試劑：如Denhardt's試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO, 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。與Denhardt's試劑相比, BLOTTO價格便宜,使用方便,同樣可獲得滿意的結(jié)果，但它不能用于RNA雜交。一般而言,尼龍膜用Denhardt's試劑比用BLOTTO能得到更高的信噪比。對硝酸纖維素濾膜而言,通常在預(yù)雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。但是對尼龍膜，經(jīng)常從雜交溶液中省去封閉劑，因為高濃度的蛋白質(zhì)會干擾探針和目的基因的退火。
(4)根據(jù)需要在雜交過程中選用不同的振蕩方法和程度,許多雜交膜一起反應(yīng)時,連續(xù)的輕微振蕩可獲得較好的雜交結(jié)果。
(5) 在雜交過程中加入其他化合物, 如反應(yīng)體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 雜交速度可增加約10倍。檢測稀有序列時常用該方法，但它們有時會導(dǎo)致本底較高，并由于溶液的粘稠性而使操作困難。因此，除非在濾膜上含有的目的DNA量很少,或放射性探針的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。
(6) 根據(jù)探針與被檢測目標之間的同源程度選擇清洗的程度,如具有很高的同源性可選用嚴緊型洗脫方式（高濃度SSC）, 反之則選用非嚴緊型洗脫方式（低濃度SSC）。洗脫通常在低于雜交體解鏈溫度12-20℃的條件下進行。解鏈溫度(melting temperature, Tm )是指在雙鏈DNA或RNA分子變性形成分開的單鏈時光吸收度增加的中點處溫度。通常富含G·C堿基對的序列比富含A·T堿基對序列的Tm 溫度高。有關(guān)Tm的計算方法，請參考第八章。
(7) 根據(jù)標記探針的濃度及其比活性,選擇不同的雜交條件及檢測方法。一般使用新的同位素可獲得較強的信號。
(8) 在水溶液中雜交時,用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一樣。但在甲酰胺溶液中雜交時,應(yīng)該用具有更強緩沖能力的6×SSPE。
上述這些條件的改變，對雜交的結(jié)果有不同的影響，應(yīng)根據(jù)研究的具體情況，選用適當(dāng)?shù)姆椒ā?
