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固相膜核酸分子雜交方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-05

  1.DNA的變性 DNA變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵。Southern印跡雜交時(shí)DNA在凝膠中變性,變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用數(shù)倍體積的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性,但強(qiáng)酸會(huì)使核酸降解。一般認(rèn)為堿變性較好,可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度(100μg/ml)和低鹽濃度(0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L檸檬酸三鈉,pH7.0)下進(jìn)行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml,加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L(pH約12.8),室溫變性10min,很快置冰鹽水中,用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4調(diào)pH到7~8[亦可用堿變性后,調(diào)至中性,再加熱100。c 10min],DNA變懷可用OD260增加(約30%~40%)來(lái)檢測(cè),變性DNA醇沉淀呈雪樣,完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC,冰浴保存。

  2.變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定 硝酸纖維素濾膜(孔徑0.45μm)先在蒸餾水中充分浸泡,再用6×SSC浸泡30min~2h,涼干。DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后,先室溫干燥4h,然后在80。C真空干燥2h。

  3.預(yù)雜交 濕潤(rùn)的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中,按每平方厘米濾膜加0.2ml預(yù)熱至60。C的預(yù)雜交液(6×SSC,0.5%,SDS,5×Denhardt液,100μg/ml鮭魚(yú)精DNA)。鮭魚(yú)精DNA需經(jīng)過(guò)剪切和DNA酶消化處理,然后酒精沉淀純化,調(diào)濃度至10mg/ml,用前放100。C水浴中煮沸變性10min,冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡,可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68。C水浴保溫3~12h。當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68。C時(shí),在濾膜表面常會(huì)形成小氣泡。輕輕晃動(dòng)袋中液體即可除去這些小氣泡,這一點(diǎn)對(duì)于保證濾膜表面充分浸潤(rùn)預(yù)雜交液很重要。

  4.雜交 從水浴中取出塑料袋,用剪刀剪開(kāi)一角,盡可能擠凈預(yù)雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中,用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤(rùn)(50μl/cm2)。溶液的組成是6×SSC,0.01mol/l EDTA, 變性的標(biāo)記核酸探針,5×Denhardt液,0.5%SDS, 100μg/ml變性的鮭魚(yú)精DNA。盡可能趕盡氣泡后,將塑料袋嚴(yán)密封口,雜交反應(yīng)在68℃水浴中進(jìn)行,所需時(shí)間視探針和檢測(cè)靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定,一般4~20h。

  5.洗膜 取出塑料袋,用剪刀剪開(kāi),小心取出濾膜,立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤中,室溫下漂洗5min。再將濾膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中,室溫下洗滌15min(輕輕搖動(dòng))。然后將濾膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中;68℃輕輕搖動(dòng)保溫2h,更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。

  洗膜的溫度一般應(yīng)控制在低于Tm值12℃以上。(Tm = 69.3 0.41x(G C) %)。雙鏈DNA的Tm值隨錯(cuò)配堿基對(duì)數(shù)每增加1%而遞減1℃。

  6.結(jié)果顯示 固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式,一是放射性自顯影法,另一種是液閃計(jì)數(shù)法。前一種方法比較簡(jiǎn)單,只需將雜交膜與X光片在暗盒中曝光數(shù)小時(shí)至數(shù)天,再顯影、定影即可。對(duì)于雜交信號(hào)較弱的固相膜,用一塊增感屏可顯著增強(qiáng)曝光強(qiáng)度。此外,為了減弱32P的散射,曝光通常在-20℃或-80℃下進(jìn)行。液閃計(jì)數(shù)法主要用于打點(diǎn)和狹縫雜交及為了比較兩個(gè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱等情形。方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊(每份樣品1塊),80℃真空干燥后裝閃爍瓶。加入2~5ml閃爍液,剪2~3塊無(wú)樣品膜塊作為本底對(duì)照。在液體閃爍計(jì)數(shù)器上自動(dòng)計(jì)數(shù)。液體計(jì)數(shù)測(cè)定放射性強(qiáng)度也可在放射自顯影之后進(jìn)行。

 

 

 
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