1．缺口平移　該技術(shù)由Kelly等于1970年創(chuàng)立。其原理是首先用DNA酶在雙鏈DNA探針?lè)肿拥囊粭l鏈上制造一些缺口（nick ）,缺口處會(huì)形成3’—羥基末端，這時(shí)再在大腸桿菌DNA聚合酶I的催化下將核苷酸殘基加在3’－羥基上，同時(shí)，根據(jù)大腸桿菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶將缺口5’側(cè)核苷酸依次切除。其結(jié)果是在缺口平移（nick tr－anslation）。根據(jù)這個(gè)原理，如果用高強(qiáng)度的放射性核苷酸（通常為α-32PdATP）置換先前存在的核苷酸，則可制備比活性高達(dá)108cpm（每分鐘計(jì)數(shù)）/μg的32P標(biāo)記DNA。用缺口平移法標(biāo)記的DNA探針能滿足大多數(shù)雜交要求。

　　2．DNA快速末端標(biāo)記　大腸桿菌DNA聚合酶i 經(jīng)枯草桿菌蛋白酶切割可得到兩條多肽鏈，其中分子量為76kd的大片段稱為Klenow片段。該酶具有完整聚合酶I的5’→3’聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，但缺乏5’→3’核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填補(bǔ)由限制酶消解DNA所產(chǎn)生的3’凹陷末端。因此，用這種方法可以標(biāo)記雙鏈DNA的凹陷3’末端。用Klenow片段標(biāo)記末端一般只用一種[α-32P]dNTP，加入反應(yīng)的[α-32P]dNTP取決于DNA末端延伸的5’末端序列，例如，用Ecor I切割DNA所產(chǎn)生的末端用[α-32P]dNTP標(biāo)記。標(biāo)記反應(yīng)可在一種限制酶消解DNA后立即進(jìn)行，不需去除限制酶或使其失活，也不需更換緩沖液，具有3’延伸的DNA末端不能被Klenow片段有效在標(biāo)記，欲標(biāo)記這類分子可用T4DNA聚合酶。

　　選用這種標(biāo)記方法是為了產(chǎn)生可用于凝膠電泳時(shí)作大小參照物的DNA片段。因?yàn)闃?biāo)記的DNA片段與其摩爾濃度成比例，而不與片段大小成比例，在限制酶消化物中，小的和大的片段都以相同程度被標(biāo)記。因此，可使用放射自顯影術(shù)確定不有被溴化乙錠染色所觀察到的大小DNA帶，尤其適用于Southern吸印雜交時(shí)分子量標(biāo)志物的標(biāo)記。通過(guò)選擇相應(yīng)標(biāo)記的dNTP，該法還可以只標(biāo)記DNA分子的一端。例如，若DNA片段的兩個(gè)末端分別是Bam H I和Hind III 粘膜端，在反應(yīng)中只加入[α-32P]dNTP或[α-32P]dGTP，使可選擇性標(biāo)記兩末端之一。

　　3．用T4多核苷酸激酶標(biāo)記DNa 5’末端　寡核苷酸探針或短的RNA和DNA探針可選用此法標(biāo)記，寡核苷酸探針一般多用這種標(biāo)記。T4多核苷酸激酶（polynucleotide kinase, PNK）是由T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5’－OH末端。在過(guò)量ADP存在時(shí)，也可促進(jìn)磷酸交換反應(yīng)，使PNK將DNA末端5’磷酸轉(zhuǎn)移到ADP上生成ATP，然后催化[α-32P]dNTP上的標(biāo)記磷酸轉(zhuǎn)移至DNA的5’末端，從而使DNA重新磷酸化，并藉此得到標(biāo)記。顯然，PNK標(biāo)記DNA末端需要[γ-32P]dNTP，這與前述酶促標(biāo)記方法不同。通常，對(duì)于5’磷酸化的DNA探針，要先用堿性磷酸酶去掉磷酸基團(tuán)，然后再用于PNK催化的5’末端標(biāo)記，這樣標(biāo)記效率較高。

　　4．隨機(jī)引物延伸　這是以單鏈DNA或RNA模板合成高比活性32P標(biāo)記探針?biāo)�選用的方法。原理是使長(zhǎng)6～8nt的寡核苷酸片段與變性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以每一個(gè)退火到模板上的寡核苷酸片段為引物引發(fā)DNA鏈的合成，在反應(yīng)時(shí)將[α-32P]dNTP摻入合成鏈，即得到標(biāo)記。變性處理后，新合成鏈（探針片段）與模板解離，即得到無(wú)數(shù)各種大小的探針DNA。因?yàn)樗�用寡核苷酸片段很短，在低溫條件下可與模板DNA隨機(jī)發(fā)生退火反應(yīng)，因此被稱為隨機(jī)引物（random primer）。這種隨機(jī)引物可用小牛胸腺DNA或魚(yú)精DNA制備。

　　用隨機(jī)引物法標(biāo)記的DNA探針或cDNA探針比活性顯著高于缺口平移法，且結(jié)果較為穩(wěn)定。這種方法尤其適用于真核DNA探針，因?yàn)殡S機(jī)引物來(lái)自真核DNA，其與真核序列的退火率要高于原核序列。因此，對(duì)于克隆的DAN探針，常先將插入探針DNA切下來(lái)回收后再標(biāo)記，而缺口平移法可直接用于全質(zhì)粒的標(biāo)記。

　　5．聚合酶鏈反應(yīng)　聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）是一種分子生物學(xué)新技術(shù)，由美國(guó)Cetus公司人類遺傳學(xué)部的Kary.B. Mullis于1985年創(chuàng)立。該技術(shù)利用兩個(gè)與相反鏈雜交并隨著于靶DNA兩側(cè)的寡核苷酸引物經(jīng)酶促合成特異的DNA片段，包括模板變性，引物退火和引物延伸三個(gè)步驟的反復(fù)循環(huán)，最終兩引物所夾靶DNA得到千萬(wàn)倍以上的擴(kuò)增。因此 ，PCR技術(shù)已成為一項(xiàng)極為有價(jià)值的技術(shù)并已迅速推廣應(yīng)用。

　　PCR技術(shù)有許多重要用途，其中之一便是可用來(lái)標(biāo)記高比活性DNA探針。PCR技術(shù)具有很高的特異性，可在1～2h之內(nèi)在量合成探針DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它標(biāo)記的dNTP，則探針DNA合成過(guò)程中可得到很好的標(biāo)記，標(biāo)記物的摻入率可高達(dá)70%～80%。因此，PCR標(biāo)記技術(shù)特別適用于大規(guī)模檢測(cè)和非放射性標(biāo)記。該法的缺點(diǎn)是要合成一對(duì)特異性PCR引物。使用從探針DNA上制備的小片段作引物也能取得較好的標(biāo)記效果。