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聚丙烯酰胺凝膠電泳法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-02

1.儀器裝置 通常由穩(wěn)流電泳儀和圓盤或平板電泳槽組成。其電泳室有上、下兩槽,每個(gè)槽中都有固定的鉑電極,鉑電極經(jīng)隔離電線接于電泳儀穩(wěn)流擋上。

2.試劑
(1)溶液A 取三羥甲基氨基甲烷36.6g,四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L鹽酸溶液48ml,再加水溶解并稀釋至100ml,置棕色瓶?jī)?nèi),在冰箱中保存。
(2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基雙丙烯酰胺0.74g,加水溶解并稀釋至100ml,濾過,置棕色瓶?jī)?nèi),在冰箱中保存。
(3)電極緩沖液(pH8.3) 取三羥甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀釋至1000ml,置冰箱中保存,用前稀釋10倍。
(4)溴酚藍(lán)指示液 取溴酚藍(lán)0.1g,加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0ml與90%乙醇5ml,微熱使溶解,加20%乙醇制成250ml。
(5)染色液 取0.25%(W/V)考馬斯亮藍(lán)G<[250]>溶液2.5ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(6)稀染色液 取上述染色液2ml,加12.5%(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(7)脫色液 7%醋酸溶液。

3.操作
(1)制膠 取溶液A2ml,溶液B5.4ml,加尿素2.9g使溶解,再加水4ml,混勻,抽氣趕去溶液中氣泡, 加0.56%過硫酸銨溶液2ml,混勻制成膠液,立即用裝有長(zhǎng)針頭的注射器或細(xì)滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使膠層高度達(dá)6~7cm, 然后徐徐滴加水少量,使覆蓋膠面,管底氣泡必須趕走,靜置約30分鐘,待出現(xiàn)明顯界面時(shí)即聚合完畢,吸去水層。
(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液的制備
(3)電泳 將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內(nèi),每管加供試品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液50~100μl,為防止擴(kuò)散可加甘油或40%蔗糖溶液1~2滴及0.04%溴酚藍(lán)指示液1滴,也可直接在上槽緩沖液中加0.04%溴酚藍(lán)指示液數(shù)滴,玻璃管的上部用電極緩沖液充滿,上端接負(fù)極、下端接正極。調(diào)節(jié)起始電流使每管為1mA,數(shù)分鐘后,加大電流使每管為2~3mA,當(dāng)溴酚藍(lán)指示液移至距玻璃管底部1cm處,關(guān)閉電源。
(4)染色和脫色 電泳完畢,用裝有長(zhǎng)針頭并吸滿水的注射器,自膠管底部沿膠管壁將水壓入,膠條即從管內(nèi)滑出,將膠條浸入稀染色液過夜或用染色液浸泡10~30分鐘,以水漂洗干凈,再用脫色液脫色至無蛋白區(qū)帶凝膠的底色透明為止。
(5)結(jié)果判斷 將膠條置燈下觀察,根據(jù)供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的色帶位置和色澤深淺程度進(jìn)行判斷。 相對(duì)遷移率 供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的電泳區(qū)帶有時(shí)可用相對(duì)遷移率(R'<[m]>)進(jìn)行比較。

 

 

 
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