目前用于基因治療的載體多為此種腺病毒載體。顧名思義，這種腺病毒載體不能在除包裝細(xì)胞系（293、911、PERC6等）以外的細(xì)胞中復(fù)制增殖。其共同特點(diǎn)是：缺失了腺病毒基因組中某些復(fù)制增殖所必需的基因，這部分基因的功能由輔助細(xì)胞或病毒提供。

第一代腺病毒載體：

為E1和/或E3區(qū)缺失的腺病毒，容許攜帶6.5~8kb的外源基因，外源基因表達(dá)盒（包括外源啟動(dòng)子、目的基因以及終止子）一般被插入到E1區(qū)所對(duì)應(yīng)的部分。前面提到，E3區(qū)編碼蛋白與腺病毒逃避宿主免疫監(jiān)視有關(guān)，與病毒復(fù)制增殖的關(guān)系不大，因此在構(gòu)建腺病毒載體時(shí)常常被去除，以擴(kuò)大腺病毒載體的裝載容量。E1區(qū)是腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核后立早表達(dá)的基因，對(duì)后續(xù)其他基因的表達(dá)以及病毒復(fù)制起到至關(guān)重要的作用。但是如果腺病毒載體中保留E1區(qū)，當(dāng)其感染細(xì)胞后會(huì)有大量的病毒蛋白表達(dá)，不僅對(duì)細(xì)胞有毒，還會(huì)引起很強(qiáng)的宿主抗病毒免疫反應(yīng)。為解決這一矛盾，人們?cè)谝恍┘?xì)胞系的基因組中整合了腺病毒基因組左端一段包括E1區(qū)基因的序列，構(gòu)建了所謂腺病毒包裝細(xì)胞系（如293、911以及PERC6等），這些細(xì)胞系可以反式提供E1區(qū)的功能，使E1區(qū)缺失的腺病毒載體增殖并產(chǎn)生成熟的腺病毒顆粒。雖然體外實(shí)驗(yàn)表明這種方案是可行的，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)第一代腺病毒載體仍會(huì)引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，使目的基因不能長(zhǎng)效表達(dá)。造成這種現(xiàn)象的主要原因是：一方面許多細(xì)胞有E1樣蛋白表達(dá)，即使是低水平的表達(dá)也會(huì)激活E2區(qū)基因的功能，導(dǎo)致病毒復(fù)制增殖和表達(dá)晚期蛋白，甚至?xí)�產(chǎn)生一些可復(fù)制的腺病毒（RCA, replication-competent adenovirus）；另一方面，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)以較高的MOI（感染復(fù)數(shù)，病毒/細(xì)胞 Multiply Of Infection）感染細(xì)胞時(shí)，E2區(qū)對(duì)E1區(qū)功能上的依賴可以被忽略，病毒仍可以復(fù)制并表達(dá)晚期基因。另外，第一代非增殖型腺病毒載體最多只能裝載約8kb的外源基因，這對(duì)于許多基因治療方案來(lái)說(shuō)仍是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。雖說(shuō)存在著上述一些不足，第一代復(fù)制缺陷型腺病毒載體仍然是基因轉(zhuǎn)移的一個(gè)非常好的工具，他的轉(zhuǎn)基因能力適應(yīng)于大多數(shù)的基因治療方案，能夠比較容易地獲得高滴度的病毒。它不僅可以用于基因治療，特別是腫瘤基因治療，還可以用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)以獲得基因疫苗，或是用于將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入對(duì)其他轉(zhuǎn)染方法不敏感的細(xì)胞株中。

第二代復(fù)制缺陷型腺病毒載體：

第二代復(fù)制缺陷型腺病毒載體在第一代的基礎(chǔ)上，對(duì)E2區(qū)（甚至包括E4區(qū)）基因的部分或全部進(jìn)行了缺失突變。由于對(duì)腺病毒基因組進(jìn)行了更多的缺失突變，第二代腺病毒載體的轉(zhuǎn)基因容量更大，允許插入最大約14kb的外源核苷酸序列。同時(shí)由于缺失了更多的腺病毒早期表達(dá)基因，如E1、E3、DNA聚合酶、IVa2以及pTP等，病毒蛋白的表達(dá)被進(jìn)一步降低，由第二代腺病毒載體所引起的宿主抗病毒免疫反應(yīng)與第一代比較要弱很多，因此在靶細(xì)胞中更穩(wěn)定，目的基因的表達(dá)時(shí)相也更長(zhǎng)。與第一代腺病毒載體一樣，第二代腺病毒載體的獲得有賴于輔助細(xì)胞（或）病毒提供其所缺失的反式作用元件。人們已經(jīng)建立了多個(gè)細(xì)胞株用作第二代腺病毒載體的輔助細(xì)胞，如可表達(dá)E2a區(qū)的DNA結(jié)合蛋白、E2b區(qū)的DNA聚合酶、E2b編碼的末端蛋白以及可表達(dá)全部或大部分E4區(qū)蛋白的細(xì)胞株。但是由于當(dāng)腺病毒的一些反式作用元件共同出現(xiàn)在一個(gè)細(xì)胞株內(nèi)時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而且編碼這些蛋白的DNA大都是以染色體外游離的形式存在，導(dǎo)致這些細(xì)胞株的穩(wěn)定性較差，成熟腺病毒顆粒的產(chǎn)量較低，病毒滴度下降。另外，盡管動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)第二代腺病毒載體所引起的機(jī)體免疫反應(yīng)明顯弱于第一代，但仍有少量的腺病毒晚期蛋白表達(dá)，這說(shuō)明若要完全去除腺病毒晚期蛋白表達(dá)需對(duì)腺病毒載體進(jìn)行更加深入的改造。

第三代腺病毒載體：

即所謂空殼載體（gutless or gutted adenovirus vectors）或（hdAd, helper-dependent adenovirus vector）。有關(guān)這種腺病毒載體的設(shè)想來(lái)源于對(duì)一些無(wú)感染能力的腺病毒顆粒的觀察。研究發(fā)現(xiàn)，盡管這些無(wú)感染能力腺病毒顆粒的基因組成千差萬(wàn)別，但是它們都共同含有腺病毒基因組最左端的一段序列，即包裝信號(hào)（ψ）。因此人們?cè)O(shè)想：構(gòu)建一種腺病毒載體，僅保留包括左右端ITR以及包裝信號(hào)的約500bp的順式作用元件，去除腺病毒基因組中全部的反式作用元件，而這部分功能由輔助病毒提供。這無(wú)疑是防止腺病毒晚期蛋白表達(dá)最簡(jiǎn)單、直接也是最有效的方法。它在保留了第一代新病毒載體基因轉(zhuǎn)在效率高等一些優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，外源基因的裝載容量擴(kuò)大到約37kb。由于去除了全部的腺病毒蛋白編碼序列，安全性進(jìn)一步提高，引起機(jī)體免疫反應(yīng)的可能性降低，因此外源基因的表達(dá)時(shí)相明顯延長(zhǎng)，有報(bào)道稱可達(dá)一年以上。另外，由于hdAd的主要特點(diǎn)之一是載體的血清型是由輔助病毒決定的，只需采用不同的輔助病毒，就很容易包裝出不同血清型的空殼載體，實(shí)現(xiàn)血清型轉(zhuǎn)換（serotype switching），因此hdAd可以反復(fù)經(jīng)系統(tǒng)途徑給藥，而無(wú)需擔(dān)心機(jī)體抗腺病毒中和抗體的影響。雖然hdAd有以上種種優(yōu)點(diǎn)，但其目前還只限于臨床前研究階段，主要是因?yàn)橛幸韵聝蓚�(gè)技術(shù)上的難題需要解決。首先是如何去除輔助病毒的污染。用作輔助病毒多為第一代腺病毒載體，很難用常規(guī)的方法將其與hdAd完全分開(kāi)。已有幾種方案用于這方面的研究，其中以拿大的Graham教授等人提出的用Cre/LoxP系統(tǒng)剪切輔助腺病毒包裝信號(hào)的方法最為可行，應(yīng)用也最為廣泛。具體方法是在輔助腺病毒包裝信號(hào)的兩側(cè)分別插入一段同向排列的LoxP序列（P1噬菌體Cre重組酶的特異性識(shí)別位點(diǎn)）。這種修飾對(duì)腺病毒在293細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖不會(huì)造成影響，然而這種經(jīng)修飾的輔助腺病毒一旦感染293來(lái)源的可穩(wěn)定表達(dá)Cre重組酶的293Cre細(xì)胞，Cre酶會(huì)對(duì)包裝信號(hào)兩側(cè)的LoxP位點(diǎn)進(jìn)行剪切，這種失去了包裝信號(hào)的輔助病毒仍然可以反式提供hdAd所需的各種腺病毒蛋白，卻不能包裝成成熟的腺病毒顆粒。借助高效特異的Cre/LoxP重組系統(tǒng)，hdAd與輔助腺病毒在共轉(zhuǎn)染293Cre細(xì)胞并傳過(guò)幾代之后，混雜的輔助腺病毒將降到0.1~0.01%左右。另一個(gè)需要解決的是hdAd DNA大小和填充物（stuffer）的問(wèn)題。我們知道，腺病毒顆粒的有效包裝下限是野 生型腺病毒基因組長(zhǎng)度的75%，（即約28kb）。若低于此限，則需額外插入適當(dāng)?shù)腄NA充當(dāng)填充物使其達(dá)到28kb以上，否則不被包裝或DNA分子發(fā)生重排。然而，DNA填充物的選擇對(duì)hdAd的功能非常重要。比如，以一段22kb長(zhǎng)的λ噬菌體DNA為填充物的hdAd，在體外實(shí)驗(yàn)時(shí)目的基因的表達(dá)量非常低，當(dāng)經(jīng)靜脈途徑注入小鼠體內(nèi)時(shí)會(huì)引起明顯的針對(duì)λ噬菌體DNA所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的CTL （cytotoxic T-lymphocytes）殺傷。相反，若是插入一段相似的人次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）則不僅會(huì)明顯地提高目的基因的表達(dá)，而且不會(huì)引起明顯的CTL殺傷。因此可以說(shuō)，去除腺病毒所有的編碼序列本身并不能保證目的基因的長(zhǎng)效表達(dá)，同時(shí)也說(shuō)明填充物的選擇必須非常慎重，一般應(yīng)遵守以下原則：人源化、無(wú)重復(fù)序列、無(wú)已知基因并且有與腺病毒基因組相似的GC含量。