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增殖型腺病毒系統(tǒng)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

增殖型腺病毒系統(tǒng)又稱為腫瘤特異性增殖型腺病毒,多用于腫瘤的基因治療。該載體利用腫瘤與正常組織及細(xì)胞間結(jié)構(gòu)或代謝途徑上的差異,使病毒可以特異性地靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、增殖,大量表達(dá)目的基因并最終裂解腫瘤細(xì)胞。以增殖型腺病毒載體作為腫瘤生物治療的平臺(tái),可以充分利用腺病毒體積較小、彌散能力強(qiáng)的特點(diǎn),與傳統(tǒng)的復(fù)制缺陷型腺病毒載體比較有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):病毒的大量增殖可以直接殺死感染的腫瘤細(xì)胞,并擴(kuò)散到鄰近腫瘤細(xì)胞;腺病毒溶解腫瘤細(xì)胞能釋放腫瘤抗原,提呈給樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞識(shí)別,起到"瘤苗"的作用,產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng);除了自身的溶腫瘤能力,增殖型腺病毒載體在大量復(fù)制增殖的同時(shí)還可使所攜帶的外源基因大量表達(dá),通過(guò)多種途徑殺滅腫瘤。與傳統(tǒng)的腫瘤基因治療以及化療方案不同,以增殖型腺病毒載體攜帶抗癌基因治療腫瘤過(guò)程中所表達(dá)的抗癌活性物質(zhì)不但不會(huì)因藥物半衰期而減少,從理論上講,只要腫瘤細(xì)胞存在,抗癌活性物質(zhì)就會(huì)表達(dá),直至殺滅全部的腫瘤細(xì)胞。對(duì)于增殖型腺病毒載體來(lái)說(shuō),最重要的莫過(guò)于安全性的問(wèn)題,也就是如何使其識(shí)別何者為腫瘤細(xì)胞,何者為正常細(xì)胞,換言之,就是靶向性的問(wèn)題。大體上,增殖型腺病毒載體的靶向性是通過(guò)以下三種策略實(shí)現(xiàn)的:
1) 基因缺失突變

我們知道,細(xì)胞被病毒感染后的許多表現(xiàn)與細(xì)胞在發(fā)生癌變時(shí)出現(xiàn)的變化極其相似(如,p53腫瘤抑制蛋白的失活等)。這就使利用基因敲除的方法使病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)有選擇性地復(fù)制增殖成為可能。目前在這方面的研究可以分為兩個(gè)發(fā)展方向:大段的基因敲除和有選擇性地敲除腺病毒有效復(fù)制所必須且(或者)對(duì)正常細(xì)胞有毒性但在腫瘤細(xì)胞中卻不需要的基因。前者中比較有代表性的是E1B-55kD區(qū)敲除的ONYX-015(又名dl1520,CI1042)。Bischoff JR教授認(rèn)為:腺病毒在其生活周期中早期表達(dá)的蛋白E1A可以激活宿主細(xì)胞的p53途徑使細(xì)胞凋亡,E1B-55KDa蛋白可以阻斷該途徑,使腺病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)完成完整的生活周期。因此,E1B-55kDa缺失的腺病毒感染p53功能正常的細(xì)胞后,其E1A激活宿主細(xì)胞的p53途徑,該細(xì)胞將發(fā)生凋亡,病毒不能有效復(fù)制。而在p53功能異常的細(xì)胞(50%左右腫瘤細(xì)胞的p53功能異常)內(nèi)則可以復(fù)制增殖并最終將其裂解。雖然,ONYX-015溶瘤的確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步的商榷,但在已結(jié)束的II期臨床試驗(yàn)中,用ONYX-015聯(lián)合常規(guī)化療治療頭頸部腫瘤,顯示出良好的抗腫瘤能力(總有效率63%,為迄今最有效的腫瘤生物治療的臨床報(bào)告之一)。與dl1520這種大段的基因敲除不同,增殖型腺病毒Δ24及dl922-947作為有選擇性的基因敲除的代表,缺失的是腺病毒基因組中單一的保守區(qū)E1A CR2(E1A conserved region 2),而對(duì)于其他有功能的部分并未觸及,因此這兩種病毒具有更好的靶向性,即pRb功能異常的細(xì)胞系(與p53途徑一樣,大多數(shù)的人類腫瘤細(xì)胞有pRb功能丟失的現(xiàn)象);如果將野生型的pRb轉(zhuǎn)導(dǎo)到Rb-的腫瘤細(xì)胞株內(nèi),則Δ24和dl922-947復(fù)制明顯受到抑制。無(wú)論是在體內(nèi)還是在體外實(shí)驗(yàn)中,dl922-947的殺傷能力都明顯強(qiáng)于dl1520。在人類腫瘤的裸鼠移植模型上,經(jīng)靜脈途徑給予dl922-947更是獲得了甚至超過(guò)野生型腺病毒的治療效果。

2) 利用組織/腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控病毒的復(fù)制

許多腫瘤組織特異性啟動(dòng)子已被人類所認(rèn)識(shí),可將其分為三類:①針對(duì)所有腫瘤特征的啟動(dòng)子,如缺氧啟動(dòng)子、端粒酶啟動(dòng)子等;②針對(duì)個(gè)別腫瘤特征的啟動(dòng)子,如肝癌的甲胎蛋白(AFP)啟動(dòng)子、胃腸道腫瘤的癌胚抗原(CEA)啟動(dòng)子以及乳腺癌和卵巢癌的DF3/MUC-1啟動(dòng)子等;③針對(duì)某一類組織(必需不是至關(guān)重要的組織)特征的啟動(dòng)子,如前列腺特異性抗原(PSA)啟動(dòng)子等。將組織/腫瘤特異性啟動(dòng)子插入到病毒增殖必需基因的上游,可以在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)病毒復(fù)制進(jìn)行調(diào)控,使病毒靶向特定的組織。這一類病毒又被稱為臨時(shí)性增殖型病毒(provisionally replicating virus)近年來(lái),對(duì)這方面的研究發(fā)展很快,幾乎涉及到迄今發(fā)現(xiàn)的每種啟動(dòng)子。但研究發(fā)現(xiàn),不同的啟動(dòng)子之間在特異性和對(duì)腫瘤/組織及病毒基因的調(diào)控活力方面參差不齊,因此在選擇時(shí)應(yīng)當(dāng)慎重。比如AFP啟動(dòng)子和DF3/MUC-1啟動(dòng)子調(diào)控的臨時(shí)性增殖型腺病毒分別被用于對(duì)肝細(xì)胞癌和表達(dá)MUC-1的乳腺癌的研究,均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗腫瘤活性,相反用E2F啟動(dòng)子/增強(qiáng)子對(duì)E1A進(jìn)行調(diào)控卻表現(xiàn)除出多種細(xì)胞和組織的靶向作用。應(yīng)用這一策略最成功的例子來(lái)自美國(guó)的Calydon制藥公司的CN 706。1997年,Rodriguez R等人將人類PSA基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子成功插入到5型腺病毒E1A區(qū)的上游,并將其命名為CN706,這種通過(guò)PSA啟動(dòng)子/增強(qiáng)子調(diào)控的臨時(shí)性增殖性腺病毒,在LNCaP(一種經(jīng)修飾的可產(chǎn)生PSA的細(xì)胞株)內(nèi)可以復(fù)制增殖,并高水平地表達(dá)E1A,而在DU145(不產(chǎn)生PSA的人前列腺細(xì)胞株)內(nèi)不增殖。對(duì)裸鼠移植瘤模型進(jìn)行一次CN706瘤內(nèi)注射后即不再有PSA產(chǎn)生。目前該病毒已進(jìn)入對(duì)局部復(fù)發(fā)的前列腺癌患者的I期臨床試驗(yàn)。這種策略中有一個(gè)較大的弱點(diǎn),即真核細(xì)胞的啟動(dòng)子并不能在病毒的基因組中嚴(yán)格地控制轉(zhuǎn)錄,而只需有少量的病毒產(chǎn)物(如,E1A)就足以滿足病毒增殖的需要,這就無(wú)法達(dá)到特異性的目的。研究表明,將啟動(dòng)子與病毒的基因組DNA隔絕開(kāi)來(lái)是解決這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)好方法。有人嘗試將經(jīng)過(guò)改造的帶有特異性啟動(dòng)子的病毒基因調(diào)控盒子裝入一個(gè)質(zhì)粒載體中與轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),因?yàn)樵撦d體只表達(dá)一次,病毒也就只能進(jìn)行一輪復(fù)制。另外,用組織特異性啟動(dòng)子對(duì)兩個(gè)(或更多)病毒復(fù)制必需基因進(jìn)行調(diào)控,也是一種有效途徑。比如,CN706第二代產(chǎn)品CV787,就是用兩個(gè)PSA啟動(dòng)子/增強(qiáng)子分別控制腺病毒的E1A和E1B區(qū),具有比CN706更好的靶向功能,目前也已經(jīng)進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)。

3) 對(duì)病毒外殼蛋白進(jìn)行改造

腺病毒的感染過(guò)程包括三個(gè)貫序發(fā)生卻又截然分開(kāi)的過(guò)程,即粘附、內(nèi)化和入核。任何一種成功的提高腺病毒載體靶向性的改造都應(yīng)以不影響腺病毒的這三個(gè)過(guò)程為原則。腺病毒的粘附和內(nèi)化過(guò)程分別與細(xì)胞表面的柯薩奇-腺病毒受體(CAR)和腺病毒五鄰體表面的RGD小肽(精氨酸-甘氨酸-天門(mén)冬氨酸)有關(guān)。前者與腺病毒纖維蛋白的頭部結(jié)合介導(dǎo)粘附過(guò)程,后者與細(xì)胞的整合素受體相互作用介導(dǎo)內(nèi)化;谝陨系恼J(rèn)識(shí),人們?cè)O(shè)想通過(guò)對(duì)腺病毒外殼蛋白改造以提高其靶向性,這個(gè)過(guò)程又稱為重新定靶(retargeting)。主要有以下幾種方法:

① 應(yīng)用雙特異性抗體 該方案的思路是:構(gòu)建一個(gè)雙特異性抗體,其一端是針對(duì)腺病毒頭部的單克隆抗體,另一端是一個(gè)可以與所靶向的腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合的配體。FGF2(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)受體在包括膠質(zhì)瘤、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的表面有過(guò)度表達(dá),因此構(gòu)建兩端分別為抗腺病毒頭部單抗和FGF2的雙特異性抗體可以使腺病毒靶向這些腫瘤細(xì)胞。這種治療方案目前被用于對(duì)Kaposi肉瘤和卵巢癌的治療,并正在進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)。同樣的方法也適用于在膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞表面高水平表達(dá)的EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)。Watkins等人構(gòu)建了一種EGF與抗腺病毒纖維結(jié)構(gòu)但鏈抗體的融合蛋白用于膠質(zhì)瘤的治療。這種方法的不足之處在于:由于抗腺病毒頭部的單抗與頭部之間是通過(guò)非共價(jià)連接,靜脈給藥時(shí)很容易脫離。

② 對(duì)腺病毒纖維結(jié)構(gòu)(或五鄰體亞單位)的修飾 這種方法是對(duì)上一方法的改良,其策略是對(duì)腺病毒的纖維結(jié)構(gòu)直接進(jìn)行修飾,使其可以與腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合。但進(jìn)行這種改造時(shí)需要注意兩點(diǎn)問(wèn)題:首先,腺病毒的纖維結(jié)構(gòu)是以三聚體的形式存在的,任何形式的修飾都應(yīng)以不影響這種三聚體為原則;其次,經(jīng)過(guò)修飾的纖維蛋白等同于配體,它應(yīng)該能夠被腫瘤細(xì)胞表面的特異性受體識(shí)別并與之結(jié)合。Dmitriev等人將FLAG肽插入HI環(huán),發(fā)現(xiàn)不會(huì)影響腺病毒存活和增殖。其后他們將RGD-4C肽插入HI環(huán),構(gòu)成腺病毒載體AdRGD,該病毒可通過(guò)插入肽RGD-4C識(shí)別特異性受體,使AdRGD與靶細(xì)胞特異性地相互作用。由此獲得非CAR依賴性腺病毒,使許多CAR陰性的腫瘤細(xì)胞系腺病毒感染率大幅度提高,這些腫瘤包括卵巢癌、胰腺癌、膽管癌、結(jié)腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌。


 

 

 
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