1.克隆到shRNA表達(dá)載體中的shRNA包括兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)（loop）序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由polⅢ啟動子控制。隨后在連上5-6個(gè)T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子。

2.兩個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸兩端須帶有限制性酶切位點(diǎn)。

3.Stratagene發(fā)現(xiàn)29個(gè)寡核苷酸較之原先推薦的23個(gè)寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。

4.在啟動子下游的酶切位點(diǎn)下方緊連一個(gè)C，使插入片段和啟動子有一定空間間隔以確保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。

5.ShRNA目的序列的第一個(gè)堿基必須是G以確保RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序列不以G開頭，必須在緊連正義鏈的上游加一個(gè)G。

6.ShRNA插入片段中的莖環(huán)應(yīng)當(dāng)靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的莖環(huán)都被成功的運(yùn)用過。其中包含一個(gè)獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)的莖環(huán)利于檢測帶有shRNA插入片段的克隆。在比較了眾多不同長度和序列的莖環(huán)，5'TCAAGAG3'序列最為有效。

7.5-6個(gè)T必須放置在shRNA插入片段尾部以確保RNA聚合酶III終止轉(zhuǎn)錄。

8.在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù)3個(gè)或以上的T。這可能導(dǎo)致shRNA轉(zhuǎn)錄的提前終止。