(1) 目的基因組DNA片段的制備
基本原則：DNA片段之間存在部分重疊序列；DNA片段大小均一。
分離和純化真核生物基因組DNA時(shí)，通常采用蛋白酶分解和有機(jī)相抽提的方法除掉蛋白質(zhì)及脂類等其他大分子�；蚪MDNA片段化則主要采用物理剪切法和限制性內(nèi)切酶法。
(2)外源DNA片段的全克隆
選擇適宜的載體，與外源DNA片段相連。
常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、粘粒（cosmid）以及YAC。這些載體可以克隆的DNA片段長(zhǎng)度上限分別約為10、23、45和1000kb。選擇載體的主要參數(shù)是基因組大小，即基因組DNA序列的長(zhǎng)短。
例如，構(gòu)建大腸桿菌（4.6′ 106kb）等基因組較小生物的基因組文庫(kù)時(shí)，采用質(zhì)粒作為載體便可得到滿意的結(jié)果：按每個(gè)DNA片段平均長(zhǎng)5kb計(jì)算，一個(gè)包括5000個(gè)DNA片段克隆的基因文庫(kù)就能夠代表一個(gè)完整的大腸桿菌基因組序列。構(gòu)建較大基因組的文庫(kù)時(shí)，噬菌體、粘粒以及YAC常被選作克隆載體。
通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將帶有不同DNA片段的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，獲得一套包含特定生物體所有DNA序列的克隆。
(3)期望重組子的篩選
很多方法能幫助我們從基因文庫(kù)的眾多克隆中篩選和鑒定帶有特定基因的克隆，它們大多是以雜交探測(cè)技術(shù)（hybridization probing）為基礎(chǔ)的。
雜交探測(cè)是一種利用能和目的基因序列互補(bǔ)的DNA或RNA片段為探針，通過(guò)分子雜交的手段找出帶有目的基因的DNA片段的實(shí)驗(yàn)方法。
用菌落（菌斑）原位雜交或免疫原位檢測(cè)法可快速篩選基因文庫(kù)。一般采用三步甚至兩步篩選法，可以在短時(shí)間內(nèi)完成全基因文庫(kù)的篩選，其程序?yàn)椋?br />首先制備高密度平板，使每塊平板密集分布5000-10000個(gè)菌落或噬菌班，進(jìn)行原位雜交；
由感光膠片上的斑點(diǎn)位置在原雜交陽(yáng)性平板的相應(yīng)區(qū)域挖下固體瓊脂，用新鮮培養(yǎng)基洗滌稀釋；
將稀釋液再次涂布平板，使每塊平板只含有200-500個(gè)可辨認(rèn)的菌落或菌斑；
用相同的探針進(jìn)行二輪雜交，直至準(zhǔn)確挑出期望的重組克隆。
