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用CaCl2處理制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01
1 從37℃培養(yǎng)16~20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52),或1ml新鮮的16~20h過夜培養(yǎng)物,轉(zhuǎn)到一個含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml培養(yǎng)瓶中。
于37℃振搖培養(yǎng)約2~3h(旋轉(zhuǎn)搖床200~300r/min),每隔20~30min測量OD600值≈0.4。
2.在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個,用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中,冰上放置10~20min;
3 于4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10min,回收細菌細胞;
4 將管倒置1min,以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡;
5 以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀,放于冰上 , 4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10min,回收細菌細胞;
6 每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定,此時,可以迅速將細胞分裝成小份,液氮中冰凍,-70℃貯存?zhèn)溆谩?br />7 用無菌吸頭從感受態(tài)細胞懸液中取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中,加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl,DNA≤50ng),輕旋以混勻內(nèi)容物,冰浴30min;
8 將離心管放到預(yù)加溫到42℃的水浴中,90s;
9 將混合物快速轉(zhuǎn)移到冰浴中,冷卻1-2分鐘,加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)45 分鐘,使細胞復(fù)蘇,并表達質(zhì)粒所攜帶的轉(zhuǎn)化基因;
10 將適當(dāng)體積(每個90mm平板可達200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)抗生素的平板培養(yǎng)基上。
11 將平板置于室溫至液體被吸收 ,倒置平板于37℃培養(yǎng)箱中,12~16h,平板培養(yǎng),克隆在此期間應(yīng)該出現(xiàn),否則轉(zhuǎn)化不成功。
 

 

 
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