1 DNA純度
在DNA樣品中若含有蛋白質(zhì)，或沒有去除干凈制備過程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高濃度金屬離子，均會降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。

2 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液
核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液包括氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris-HCL、巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。
使用所有限制酶均可發(fā)揮活性的一種緩沖液。
不同限制性內(nèi)切酶對NaCl濃度的要求不同，這是不同限制酶緩沖液組成上的一個主要的不同。據(jù)此可分為高鹽、中鹽和低鹽緩沖液，在進(jìn)行雙酶解或多酶解時，若這些酶切割可在同種緩沖液中作用良好，則幾種酶可同時酶切；若這些酶所要求的緩沖液有所不同，可采用以下三種方法進(jìn)行消化反應(yīng)：先用要求低鹽緩沖液的限制性內(nèi)切酶消化DNA，然后補(bǔ)足適量的NaCl，再用要求高鹽緩沖液的限制酶消化；
先用一種酶進(jìn)行酶解，然后用乙醇沉淀酶解產(chǎn)物，再重懸于另一緩沖液中進(jìn)行第二次酶解。

3 酶切消化反應(yīng)的溫度
DNA消化反應(yīng)的溫度，是影響限制內(nèi)切酶活性的一個重要因素。不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有各自的最適反應(yīng)溫度。多數(shù)限制內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度是37℃，少數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度高于或低于37℃。

4 DNA的分子結(jié)構(gòu)
DNA分子構(gòu)型對核酸內(nèi)切限制酶的活性有很大影響，如消化超螺旋的DNA比消化線性DNA用酶量要高出許多倍。
有些限制酶在消化它們自己的處于不同部位的限制位點(diǎn)，其效率也有明顯差異。
限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止 通常是采用65℃條件下溫浴5min；
加終止反應(yīng)液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的終濃度達(dá)到10 mol/L）螯合Mg2 ，以終止反應(yīng)。