一、實驗目的
本實驗以酵母RNA為材料，將RNA用堿水解成單核苷酸，再用離子交換柱層析進行分離，最后采用紫外吸收法進行鑒定。同時通過測定各單核苷酸的含量，可以計算出酵母RNA的堿基組成。
本實驗的目的是：
1. 了解掌握RNA堿水解的原理和方法
2. 掌握離子交換柱層析的分離原理和方法
3. 熟練掌握紫外吸收分析方法
二、實驗原理
1. RNA的堿水解
實驗室制備單核苷酸一般用化學水解法（酸、堿水解）和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤堿基；用堿水解可得到2’一核苷酸和3’一核苷酸的混合物；用5’一磷酸二酯酶或3’一磷酸二酯酶水解則分別可得到5’一核苷酸或3’一核苷酸。
RNA用堿水解，經(jīng)過2’、3’一環(huán)核苷酸中間物，而后水解生成2’一核苷酸和3’一核苷酸。如下圖所示。
堿水解一般采用0.3M的KOH，37℃保溫18~20小時就能水解完全（也可以用1M KOH，80℃水解60min或0.1M KOH 100℃水解20min）。水解畢，用2M HClO4中和并逐滴調(diào)節(jié)至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，離心去除之。上清液即為各單核苷酸的混合液。然后根據(jù)所選離子交換劑的類型，將上清液調(diào)至適當?shù)膒H值，作樣品液備用。一般用陽離子交換劑，pH調(diào)至1.5左右，用陰離子交換劑，pH調(diào)至8 ~ 9(逐滴)。此處用KOH是為了便于除去鉀離子以降低樣品溶液中的離子強度。
2. 單核苷酸的離子交換柱層析分離
離子交換層析是根據(jù)各種物質(zhì)帶電狀態(tài)（或極性）的差別來進行分離的。電荷不同的物質(zhì)對離子交換劑有不同的親和力，因此，要成功地分離某種混合物，必須根據(jù)其所含物質(zhì)的解離性質(zhì)，帶電狀態(tài)選擇適當類型的離子交換劑，并控制吸附和洗脫條件（主要是洗脫液的離子強度和pH值）,使混合物中各組分按親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來。
在離子交換層析中，分配系數(shù)或平衡常數(shù)（Kd）是一個重要的參數(shù)：
Kd = Cs / Cm
式中：Cs是某物質(zhì)在固定相（交換劑）上的摩爾濃度，Cm是該物質(zhì)在流動相中的摩爾濃度�？梢钥闯�，與交換劑的親和力越大，Cs越大，Kd值也越大。各種物質(zhì)Kd值差異的大小決定了分離的效果。差異越大，分離效果越好。影響Kd值的因素很多，如被分離物帶電荷多少，空間結構因素，離子交換劑的非極性親和力大小，溫度高低等。實驗中必須反復摸索條件，才能得到最佳分離效果。
核苷酸分子中各基團的解離常數(shù)（pK）和等電點 p I 值見表1。

表 1 四種核苷酸的解離常數(shù)（pK）和等電點pI值

核苷酸 第一磷酸基 pKa1 第二磷酸基 pKa2 含氮環(huán)的亞氨基（－NH =） pKa3 等電點 pI值*
尿苷酸UMP鳥苷酸GMP腺苷酸AMP胞苷酸CMP 1.0 0.7 0.9 0.8 6.4 6.1 6.2 6.3 2.4 3.7 4.5 1.55 2.35 2.65
*注：pI = (pKa1 pKa3) / 2

由表1可見,含氮環(huán)亞氨基的解離常數(shù)（ pK ）值相差較大，它在離子交換分離四種核苷酸中將起決定作用。
用離子交換樹脂分離核苷酸，可通過調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值使它們的可解離基團解離，帶上正電荷或負電荷。同時減少樣品溶液中除核苷酸外的其它離子的強度。這樣，當樣品液加入到層析柱時，核苷酸就可以與離子交換樹脂相結合。洗脫時，通過改變pH值或增加洗脫液中競爭性離子的強度，使被吸附的核苷酸的相應電荷降低，與樹脂的親和力降低，結果使核苷酸得到分離。
混合核苷酸可以用陽離子或陰離子交換樹脂進行分離。采用陽離子交換時，控制樣品液pH值在1.5，此時UMP帶負電，而AMP、CMP、GMP帶正電，可被陽離子樹脂吸附。然后通過逐漸升高pH值，將各核甘酸洗脫下來，次序是UMP-GMP-CMP-AMP。AMP與CMP洗脫位置的互換，是由于聚苯乙烯樹脂母體對嘌呤堿基的非極性吸附力大于對嘧啶堿基的吸附力造成的。
本實驗采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季銨堿型粉末陰離子樹脂（201×8）分離四種核苷酸.首先使RNA堿水解液中的其它離子強度降至0.02以下，然后調(diào)pH值至6以上，使樣品核苷酸都帶上負電荷，它們都能與陰離子交換樹脂結合。結合能力的強弱，與核苷酸的pI 值有關，pI 越大，與陰離子交換樹脂的結合力越 弱，洗脫時越易交換下來。由表1可見，當用含競爭性離子的洗脫液進行洗脫時，洗脫下來的次序應該是CMP、AMP、GMP和UMP。由于本實驗所用的樹脂的不溶性基質(zhì)是非極性的,它與嘌呤堿基的非極性親和力大于與嘧啶堿基的非極性親和力。所以，實際洗脫下來的次序為：CMP、AMP、UMP和GMP。對于同一種核甘酸的不同異構體而言，它們之間的差別僅在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2’—磷酸基較3’—磷酸基距離堿基更近，因而它的負電性對堿基正電荷的電中和影響較大,其pK 值也較大。例如2’-胞苷酸的pK1=4.4 ，3’-胞苷酸的pK1 = 4.3 ，因此2’一核苷酸更易被洗脫下來。
應注意的是，樣品不易過濃，洗脫的流速不宜過快，洗脫液的pH值要嚴格控制。否則將使吸附不完全，洗脫峰平坦而使各核苷酸分離不清。
3. 核苷酸的鑒定
由于核苷酸中都含有嘌呤與嘧啶堿基，這些堿基都具有共軛雙鍵（—C=C—C=C—），它能夠強烈地吸收250~280毫微米波段的紫外光，而且有特征的紫外吸收比值。因此，通過測定各洗脫峰溶液在220~300毫微米波長范圍內(nèi)的紫外吸收值，作出紫外吸收光譜圖，與下圖所示的標準吸收光譜進行比較，并根據(jù)其吸光度比值（250nm/260nm, 280nm/260nm, 290nm/260nm）以及最大吸收峰與下頁“表2”所列標準值比較后，即可判斷各組分為何種核苷酸。
根據(jù)各組分在其最大吸收波長（lmax）處總的吸光度（總Amax ）以及相應的摩爾消光系數(shù)（E260 nm）, 可以計算出RNA中四種核苷酸的微摩爾數(shù)和堿基摩爾數(shù)百分組成。

四種核苷酸在pH = 2 ~ 4時的紫外吸收光譜曲線

（1）

（2）

溶液的pH值對核苷酸的紫外吸收光度值影響較大，故測定時需要調(diào)至一定的pH值。
三、試劑與器材
試劑：
1. 酵母RNA
2. 強堿型陰離子交換樹脂201×8。聚苯乙烯 一 二乙烯苯 一 三甲胺季銨堿型，全交換量大于3毫摩爾/克干樹脂，粉末型100~200目。
3. 1M甲酸：21.4ml 88%甲酸定容至500ml。
4. 1M甲酸鈉：34.15g純甲酸鈉（注意結晶水問題）用蒸餾水溶解，定容至500ml。
5. 0.3 M KOH: 1.68g KOH用蒸餾水溶解定容至 100ml。
6. 2 M過氯酸HClO4：17ml 過氯酸( 70~72 % )定容至100ml。
7. 2 M NaOH (50ml)，0.5 M NaOH (100ml)。
8. 1M HCl（100ml）。
9. 1% AgNO3溶液。
器材：
1. 層析柱
2. 梯度洗脫器，電磁攪拌器
3. 恒流泵
4. 自動部分收集器
5. 酸度計
6. 紫外分光光度計
7. 旋渦混合器
8. 核酸蛋白檢測儀
9. 臺式離心機
四、操作步驟
1. RNA的堿水解：
稱取20mg酵母RNA，置于刻度離心試管中，加2ml新配制的0.3 M KOH, 用細玻璃棒攪拌溶解，于37℃水浴中保溫水解20小時。然后用2M HClO4（過氯酸）調(diào)水解液pH至2以下（要少量多次，只需幾滴即可）。由于核苷酸在過酸的條件下易脫嘌呤，所以滴加HClO4時需用旋渦混合器迅速攪拌，防止局部過酸，再以4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，置冰浴中10分鐘，以沉淀完全。將清液倒入另一刻度試管中，用2 M NaOH逐滴將清液pH值調(diào)至8～9，作上樣樣品液備用。樣品液上柱前，取0.1ml稀釋到500倍，測定其在260nm波長處的光吸收值，用以最后計算離子交換柱層析的回收率。
2. 離子交換樹脂的預處理：
取201×8粉末型強堿型陰離子交換樹脂8克（濕），先用蒸餾水浸泡2小時，浮選除去細小顆粒，同時用減壓法除去樹脂中存留的氣泡，然后用四倍樹脂量的0.5M NaOH溶液浸泡1小時，除去樹脂中的堿溶性雜質(zhì)。用去離子水洗至近中性后，再用四倍量 1M HCl浸泡半小時，以除去樹脂中酸溶性雜質(zhì)。接著用蒸餾水洗至中性（可以上柱洗），此時陰離子交換樹脂為氯型。
3. 離子交換層析柱的裝柱方法：
離子交換層析柱可使用內(nèi)徑約1cm、長10 cm的層析柱，柱下端有燒結上的垂熔濾板，柱上端使用橡皮塞，塞子中間打一小孔。緊緊插入一根細聚乙烯管，層析柱夾在鐵架臺上，調(diào)成垂直，柱下端細膠管用螺旋夾夾緊，向柱內(nèi)加入蒸餾水至2/3柱高，再用滴管將經(jīng)過預 處理的離子交換樹脂加入柱內(nèi)，使樹脂自由沉降至柱底，放松螺旋夾，使 蒸餾水緩慢流出，再繼續(xù)加入樹脂，使樹脂最后沉降的高度約為6~7cm.。注意在裝柱和以后使用層析柱的過程中，切勿干柱，樹脂不能分層，樹脂面以上要保持一定高度的液面（不能太高，約1cm），以防氣泡進入樹脂內(nèi)部，影響分離效果。
4. 樹脂的轉(zhuǎn)型處理：
樹脂的轉(zhuǎn)型處理就是使樹脂帶上洗脫時所需要的離子。本實驗需要將陰離子交換樹脂由氯型轉(zhuǎn)變?yōu)榧姿嵝停�先�?00ml 1M 甲酸鈉洗柱，用1%AgNO3檢查柱流出液，直至不出現(xiàn)白色AgCl沉淀為止。然后改用約200ml 0.2M甲酸繼續(xù)洗柱，測定流出液的A260 ≤ 0.020為止。最后用蒸餾水洗柱，直至流出液的pH值接近中性（或與蒸餾水的pH相同）。
5. 加入樣品并淋洗除去不被樹脂吸附的組分：
加樣就是將RNA堿水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到離子交換層析柱內(nèi)，使其被離子交換樹脂吸附。先將柱內(nèi)液體用滴管輕輕吸去，使液面下降到剛接近樹脂表面。旋緊下端螺旋夾，用滴管準確移取1.0 ml RNA堿水解樣品液，沿柱壁小心加到樹脂表面，然后松開下端螺旋夾，使樣品液面下降至樹脂表面，接著用滴管加入少量蒸餾水，當水面降至樹脂表面時，再用約200ml蒸餾水洗柱，將不被陰離子交換樹脂吸附的嘌呤及嘧啶堿基，核苷等雜質(zhì)洗下來。檢查流出液在260nm波長處的吸光度，直至低于0.020為止。關恒流泵，旋緊柱下端螺旋夾。
6. 梯度洗脫：
在梯度洗脫器的混合瓶內(nèi)加入300ml蒸餾水，貯液瓶中加入300ml 0.20M甲酸—0.20M甲酸鈉混合液（注意：梯度洗脫器底部的連通管要事先充滿蒸餾水，趕盡氣泡）。洗脫器出口與恒流泵入口用細塑料管相連，打開兩瓶之間的連通伐和出口伐，打開電磁攪拌器，松開柱下端螺旋夾，開啟恒流泵，控制 流速為5ml / 管 / 10分，開啟部份收集器，分管收集流出液。以蒸餾水為對照，測定各管在260nm波長下的A260值，，給各管編號，并標出最高峰的收集管。
7. 核苷酸的鑒定：
分別測定最高峰管內(nèi)液體在230nm ~ 300nm之間，每相差5nm間隔的光吸收值。其中包括有250、260、280，290nm各點（注意：液體均要保留，切勿倒掉。測量時用石英杯）。由于在小于250nm時，甲酸（ HCOOH ）具有很強的光吸收值，因此測定時所用參比對照液近似為：
第一個峰用0.05M甲酸—0.05M 甲酸鈉
第二個峰用0.10M甲酸—0.10M甲酸鈉
第三個峰用0.15M甲酸—0.15M甲酸鈉
第四，五兩峰用0.20M甲酸¾ 0.20M甲酸鈉
也可以根據(jù)最高峰所在位置，計算甲酸、甲酸鈉的濃度選擇參比液。
8. 測定各種核苷酸的含量和總回收率：
分別合并（包括最高峰管在內(nèi)）各組份洗脫峰管內(nèi)的洗脫液，用量筒測出溶液總體積，然后測定其 A260值，參比對照液同上。根據(jù)層析柱上樣液的A260值以及層析后所得到的各組份A260值之和，可以計算出離子交換柱層析的回收率。（注：RNA 的摩爾消光系數(shù)E260nm為 7.7 ~ 7.8×10³，水解后增值 40 % )。
9. 樹脂的再生：
使用過的離子交換樹脂經(jīng)過再生處理后，可重復使用�？梢栽谥鶅�(nèi)處理，也可以將樹脂取出后處理。取出樹脂的方法是用橡皮球由層析柱的下端向柱內(nèi)吹氣，用燒杯收集流出的樹脂。樹脂再生的方法與未使用的新樹脂預處理方法相同。也可以直接用1M NaCl溶液浸泡或洗滌，最后用蒸餾水洗至流出液的pH值接近中性。
五、結果處理
1. 作出陰離子交換樹脂柱層析分離核苷酸的洗脫曲線，以層析流出液管數(shù)（或體積）為橫座標，以相應的A 260值為縱座標，作出洗脫曲線圖。
2. 作出各單核苷酸的紫外吸收光譜圖，根據(jù)各組份溶液在230~300nm波長范圍內(nèi)的吸光度值，以波長（nm）為橫座標，吸光度值為縱座標，作出它們的吸收光譜圖。由圖上求出每個單核苷酸組分的最大吸收峰的波長值 lmax ，同時，計算出各個組份在不同波長的吸光度值比值（250/260，280/260，290/260），將它們與各核苷酸的標準值（見表2，取pH=2和pH=7兩組值的平均值為標準值）列表比較，從而鑒定出各組份為何種核苷酸。
3. 根據(jù)各組份溶液的合并體積（V），平均吸光度值（A260）,再查出該核苷酸的摩爾消光系數(shù)（E260），從而可以計算出每個核苷酸的微摩爾數(shù)（m）。
因為： m = C · V
濃度 L（比色杯光程）= 1 cm
則： ( 微摩爾 )
由此，可以計算出各核苷酸的相對摩爾百分含量以及嘌呤與嘧啶的相對摩爾數(shù)比值。然后討論RNA中嘌呤與嘧啶的摩爾數(shù)比值關系。
4. 根據(jù)層析上樣液 A260值，以及層析后所得到的各組份 A260值之和，計算出離子交換柱層析的回收率。