方法一:
1. 標(biāo)本預(yù)處理:將1ml EDTA抗凝貯凍血液于室溫解凍后移入5ml離心管中,加入1ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS),混勻,3500g離心15min,傾去含裂解紅細(xì)胞上清。重復(fù)一次。用0.7ml DNA提取液混懸白細(xì)胞沉淀,37℃水浴溫育1h。
2. 消化:上述DNA提取液混懸白細(xì)胞,37℃水浴溫育1h后,加入1mg/ml蛋白酶K 0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉(zhuǎn)動(dòng)混勻,液體變粘稠。50℃水浴保溫3h,裂解細(xì)胞,消化蛋白。保溫過(guò)程中,應(yīng)不時(shí)上下轉(zhuǎn)動(dòng)幾次,混勻反應(yīng)液。
3. 酚抽提純化DNA:上述反應(yīng)液冷卻至室溫后,加入等體積的飽和酚溶液,溫和地上下轉(zhuǎn)動(dòng)離心管5-10min,直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000g離心15min,用大口吸管小心吸取上層粘稠水相,移至另一離心管中。重復(fù)酚抽提一次。加等體積的氯仿﹕異戊醇(24﹕1),上下轉(zhuǎn)動(dòng)混勻,5000g離心15min,用大口吸管小心吸取上層粘稠水相,移至另一離心管中。重復(fù)一次。
4. 加入1/5體積的3mol/L NaAc及2倍體積的預(yù)冷的無(wú)水乙醇,室溫下慢慢搖動(dòng)離心管,即有乳白色云絮狀DNA出現(xiàn)。用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA,轉(zhuǎn)入另一1.5 ml離心管中,加70%乙醇0.2ml,5000g離心5min洗滌DNA,棄上清,去除殘留的鹽。重復(fù)一次。室溫?fù)]發(fā)殘留的乙醇,但不要讓DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于搖床平臺(tái)緩慢搖動(dòng),DNA完全溶解通常需12-24小時(shí)。
5. DNA的濃度測(cè)定及純度判定:取DNA溶液用TE液做適量稀釋?zhuān)訲E液作空白對(duì)照,在紫外分光光度計(jì)上讀取A260和A280的光密度值。
按下面公式計(jì)算濃度: DNA濃度(ug/ul)= A260*50*稀釋倍數(shù)/1000
DNA純度的判定: A260/A280 比值應(yīng)介于1.7-2.0之間。
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方法二:
分別采集外周靜脈血5ml,2%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝待用(要求采血至分離白細(xì)胞之間隔時(shí)間在室溫下放置不超過(guò)2h,4℃放置不超過(guò)5h,以防白細(xì)胞自溶)。
采用NaI提取法提取外周血白細(xì)胞基因組。
(1)取外周抗凝血(全血)100ul于Ep管中,12000rpm離心12min
(2)棄上清,加雙蒸水200ul溶解,搖勻20s
(3)混勻后加6M NaI溶液200ul,搖勻20s
(4)加氯仿/異戊醇(24:1)400ul,即加即搖,搖勻20s,12000rpm離心12min。
(5)取上層液350ul,加入另一新Ep管中,加0.6倍體積異丙醇,搖勻20s,室溫放置15min,靜置后的反應(yīng)體系15000rpm離心12min,使沉淀緊貼Ep管壁。
(6)棄異丙醇,加70%乙醇1ml(不振動(dòng)),15000rpm離心12min。
(7)棄乙醇,敞開(kāi)Ep管蓋, 烘干(37℃恒溫箱)后,加1xTE溶液30ul,溶解DNA>12h以上,制成的DNA液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?