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病毒基因工程

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

1953WatsonCrick發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),開創(chuàng)了分子生物學(xué)的新時(shí)代。三十多年來有關(guān)DNA的研究有了飛躍的發(fā)展。基因工程就是指在試管內(nèi)人為地把DNA分子進(jìn)行切割、拼接(即重組),再設(shè)法把它放回到細(xì)胞中去進(jìn)行擴(kuò)增,并表達(dá)產(chǎn)生人們所需要的蛋白。這樣就可以按照人們的意愿創(chuàng)造新的生命形態(tài),表現(xiàn)新的遺傳學(xué)特往。這種DNA重組技術(shù),不僅使基因研究在理論上有新的突破,而且產(chǎn)生了基因工程工業(yè)。它被認(rèn)為是二十世紀(jì)生物學(xué)一項(xiàng)偉大的成就,也是當(dāng)今第三次工業(yè)革命的重要組成部分。

病毒基因工程,就是指DNA重組技術(shù)在病毒學(xué)中的應(yīng)用。它是近十年來基于分子病毒學(xué)、分子生物學(xué)、微生物遺傳學(xué)以及細(xì)胞生理學(xué)的發(fā)展而形成的一個(gè)邊緣性的應(yīng)用科學(xué)領(lǐng)域。病毒基因工程技術(shù),不僅對(duì)病毒學(xué)本身規(guī)律的基礎(chǔ)研究十分重要,而且更主要的它又是研究病毒性疾病防治關(guān)鍵問題的一種必要手段。 

一、病毒學(xué)發(fā)展的三個(gè)階段

 

隨著生物學(xué)研究技術(shù)的不斷革新,病毒學(xué)的發(fā)展大致經(jīng)歷了如下三個(gè)階段。

(一)機(jī)體水平研究階段

40年代以前,病毒學(xué)工作者主要采用敏感動(dòng)物(如小白鼠)或動(dòng)物胚胎(如雞胚)來分離、鑒定病毒,研究病毒的繁殖、發(fā)病機(jī)理、兔疫反應(yīng)等,甚至使用受染動(dòng)物組織制備疫苗,如狂犬病疫苗等。

(二)細(xì)胞水平研究階段

4060年代,由于組織培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)領(lǐng)域,相繼分離了上百種過去對(duì)動(dòng)物不敏感的新病毒,如腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、ECHO病毒等,大大擴(kuò)展了病毒學(xué)研究的范圍。組織培養(yǎng)技術(shù)不僅為臨床病毒學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ),而且還用于病毒復(fù)制和遺傳方面的研究,對(duì)病毒本質(zhì)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。此外,一批經(jīng)濟(jì)、安全、有效的組織培養(yǎng)疫苗誕生了,如脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎疫苗等,為預(yù)防病毒性疾病做出了貢獻(xiàn)。

(三)分子水平研究階段

60

另一方面,分子病毒學(xué)的研究成果,對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展也起了很大的推動(dòng)作用。RNA腫瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn),不僅充實(shí)了闡明DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和mRNA的翻譯表達(dá)及蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)功能三者關(guān)系的中心法則,而且在實(shí)際應(yīng)用上,使RNA在試管內(nèi)反轉(zhuǎn)錄成cDNA成為可能。病毒基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)的研究,還闡明了有關(guān)真核基因表達(dá)調(diào)控的某些原理,如基因重疊、間隙、內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄后剪修,重復(fù)序列和增強(qiáng)子的存在等,都大大豐富了分子生物學(xué)的內(nèi)容。病毒載體的出現(xiàn),又為研究真核細(xì)胞基因表達(dá)提供了一個(gè)重要的手段。目前,分子病毒學(xué)還處于發(fā)展階段。

 

二、病毒基因工程的主要內(nèi)容和重要性

 

根據(jù)目前DNA重組技術(shù)的發(fā)展及分子病毒學(xué)研究的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì),病毒基因工程包括如下主要內(nèi)容。

(一)病毒基因組的克隆、結(jié)構(gòu)測(cè)定和表達(dá)

要研究病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,一般須先建立病毒基因組的無(wú)性繁殖系,這樣才能獲得足夠量的病毒DNA。后者可采用細(xì)菌質(zhì)粒、粘性質(zhì);λ噬菌體作為載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌來完成。大的DNA病毒基因組可用限制性內(nèi)切酶切割成幾個(gè)片段進(jìn)行克;RNA病毒可先在試管內(nèi)反轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行克;反轉(zhuǎn)錄病毒基因組可克隆其前病毒DNA。建立了病毒基因組的無(wú)性繁殖系后,就可以采用化學(xué)法(Maxam et al 1977)或酶促法(Sanger et al 1977Messing et al 1981)測(cè)定病毒基因組的核苷酸序列,以了解基因的一級(jí)結(jié)構(gòu);結(jié)合在試管內(nèi)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯試驗(yàn),或基因缺失變異株的互補(bǔ)試驗(yàn)等,就可逐步闡明其結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系,并了解基因表達(dá)調(diào)控的某些原理。在此基礎(chǔ)上,就可以設(shè)計(jì)組建病毒載體或表達(dá)病毒多肽。。

 

(二)病毒基因工程疫苗的研制

對(duì)產(chǎn)生中和抗體的病毒多肽基因高效表達(dá)的研究,導(dǎo)致了新一代病毒疫苗的誕生。鑒于動(dòng)物病毒的自然宿主是動(dòng)物細(xì)胞,所以動(dòng)物病毒基因表達(dá)的模式與其他真核基因是類似的。眾所周知,真核基因與原核基因的表達(dá)調(diào)節(jié),在許多方面是不相同的(表12),其中最主要的是真核基因的不連續(xù)性,以及其調(diào)控信號(hào)不能為原核細(xì)胞正確識(shí)別。所以病毒基因在一般情況下,最好采用真核細(xì)胞系統(tǒng)來表達(dá)。也就是說,病毒基因工程疫苗要采用真核細(xì)胞系統(tǒng)來完成?墒,如果病毒基因先在試管內(nèi)從mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用原核細(xì)胞的啟動(dòng)子,也可以在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。目前,用于制備病毒基因工程疫苗的表達(dá)系統(tǒng)的種類和優(yōu)缺點(diǎn)詳見表13

 

病毒基因工程疫苗雖然還存在一些問題,但是與采用經(jīng)典方法生產(chǎn)的病毒疫苗相比較,仍有許多明顯的優(yōu)點(diǎn):

1

2.

3

4

5

(三)抗病毒多肽物質(zhì)的研制

如表14所示,自1979年底以來,不少人和動(dòng)物的干擾素基因已經(jīng)克隆成功。人

干擾素基因在原核細(xì)胞中已可高效表達(dá),每升大腸桿菌菌液可以生產(chǎn)lmg干擾素,相當(dāng)于23×108國(guó)際單位干擾素。采用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的干擾素具有與自然干擾素相同的生物學(xué)活性,目前已經(jīng)試用于臨床。采用基因工程技術(shù)還可以把幾個(gè)不同型別的干擾素基因拼接起來,生產(chǎn)具有不同性格的自然界所沒有的活性多肽物質(zhì),例如把αD-αA基因拼接后產(chǎn)生的干擾素,既具有具αD的某些性狀,又具有αA的一些性狀。所以DNA重組技術(shù)為生產(chǎn)人造抗病毒多肽物質(zhì)開辟了一條新途徑。

(四)動(dòng)物病毒載體的組建

原核細(xì)胞系統(tǒng)的DNA重組技術(shù),對(duì)真核基因,包括動(dòng)物病毒基因的克隆、鑒定,無(wú)疑是十分必要的,因?yàn)檎婧嘶蚬こ痰钠鹗疾襟E,多先在原核細(xì)胞內(nèi)完成。但是,正如表12所示,真核基因與原核基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)調(diào)節(jié)有很大的差別,要進(jìn)行病毒基因或其他直接基因的表達(dá)調(diào)節(jié)研究,就必須建立一種真核基因工程系統(tǒng)?紤]到λ噬菌體載體(一種細(xì)菌的病毒)在大腸桿菌克隆系統(tǒng)中表現(xiàn)出很多優(yōu)點(diǎn),許多學(xué)者也就對(duì)采用動(dòng)物病毒作為真核細(xì)胞克隆和表達(dá)的載體,寄予很大的希望?墒,動(dòng)物病毒與噬菌體各有許多不同的特點(diǎn),在使用或改組動(dòng)物病毒作為載體時(shí),應(yīng)當(dāng)注意下列問題:

1

但是,痘苗病毒基因組比較大,有較大的非必需區(qū),作為病毒載體是很有前途的。

2.

3

4

動(dòng)物病毒載體的組建有兩種類型:第一是組建含有目的基因的感染性重組病毒,隨著病毒的繁殖,使目的基因有效表達(dá)。采用這一系統(tǒng)時(shí),除反轉(zhuǎn)錄病毒外,大多數(shù)感染性病毒可以殺死細(xì)胞。第二是建立一種能使病毒載體復(fù)制的游離基因,其優(yōu)點(diǎn)是,可以用來建立不產(chǎn)生感染性病毒顆粒就可以不斷表達(dá)外源性基因的細(xì)胞系,而且還可以克服病毒顆粒包裝容量的限制。根據(jù)不同目的和要求,這兩類動(dòng)物病毒載體各有其用處。

動(dòng)物病毒載體的用途有如下幾方面:

1

2

3

4

 

三、病毒基因工程的主要環(huán)節(jié)

 

(一)供體DNA或外源性DNA

它可以通過提取、人工合成或從mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得。由于大多數(shù)真核基因和病毒基因有插入順序,所以從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA往往不能完全代表真核基因的真正結(jié)構(gòu)。

(二)載體

載體也就是轉(zhuǎn)移外源性DNA片段的運(yùn)載體,常用的有細(xì)菌質(zhì)粒、粘性質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒、噬菌體或動(dòng)物病毒。根據(jù)不同的目的和要求選用不同的載體系統(tǒng),也可不用載體把外源性DNA直接轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。

(三)受體細(xì)胞

受體細(xì)胞就是指作為DNA重組體增殖或復(fù)制的宿主細(xì)胞。如果采用細(xì)菌時(shí),要考慮到安全性。目前認(rèn)為,大腸桿菌K12品系是安全的。如采用動(dòng)物細(xì)胞來生產(chǎn)疫苗或其他活性多肽時(shí),要考慮到潛在的致癌因子。

(四)重組體的改造與基因表達(dá)

外源性DNA與載體DNA的連接,以及重組體的改造大致有如下幾種方法:

1

2

3

4.

5

6

基因表達(dá)考慮的因素較多?偨Y(jié)病毒基因工程的主要環(huán)節(jié)如表1-5

.人工合成一個(gè)DNA片段,含有一定的酶切點(diǎn)以及所需要的序列。
.加上人工合成的接頭,造成一定的內(nèi)切酶粘性末端;
用末端轉(zhuǎn)移酶在3′端加上dAdT,或 dCdG后進(jìn)行接連;
.使粘端修飾成平端,或用Bal 3l修飾后,再進(jìn)行平端連接;
T4DNA 連接酶進(jìn)行平端連接;
T4DNA 連接酶進(jìn)行粘端連接;
.人類遺傳病的基因治療。
.利用病毒基因組中的基因表達(dá)增強(qiáng)子;
.高效表達(dá)真核基因,用于研制病毒疫苗或生產(chǎn)多種活性多肽物質(zhì);
.研究真核基因表達(dá)調(diào)控原理;
.在動(dòng)物病毒載體中,要考慮基因表達(dá)增強(qiáng)子的作用。而在λ噬菌體,目前尚未見報(bào)道。
.在病毒載體中,目前還沒有有效的可以控制病毒基因轉(zhuǎn)錄的具體方法。而在λ噬菌體的克隆實(shí)驗(yàn)中,可以采用λcIts857的溶原性細(xì)菌或帶有cIts857的質(zhì)粒來控制PL啟動(dòng)子。采用這樣的系統(tǒng),就可以表達(dá)許多對(duì)細(xì)菌本身有毒性的多肽。
動(dòng)物病毒作為載體,首先要求對(duì)該病毒的轉(zhuǎn)錄機(jī)制有清楚的了解。因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下,真核基因克隆的目的是要使插入基因能夠高效表達(dá);而在λ或M13噬菌體的大多數(shù)工作中,基因克隆的目的大都是為了使外源性DNA進(jìn)行擴(kuò)增或者進(jìn)行序列分析。
.作為載體的多數(shù)病毒基因的非必需區(qū)比較短。在設(shè)計(jì)λ噬菌體載體時(shí),最簡(jiǎn)單的途徑就是先確定一個(gè)對(duì)溶細(xì)胞性生長(zhǎng)不必要的基因片段,然后在這一非必需區(qū)替代外源性DNA;在設(shè)計(jì)動(dòng)物病毒載體時(shí),外源性DNA往往代替了病毒基因的必需區(qū)。因此,重組病毒是絕對(duì)缺損性的,必須在輔助病毒存在的條件下才能繁殖,或者在染色體中已整合有輔助病毒基因的細(xì)胞中才能生長(zhǎng)。再者,能夠作為感染性病毒繁殖的重組DNA分子大小,還要受到病毒顆粒包裝容量的限制,目前還沒有動(dòng)物病毒的試管內(nèi)包裝系統(tǒng)。
.可以制備單一成分病毒疫苗,也可以制備同一病毒的多個(gè)成分的病毒疫苗。
.可以完全去除病毒基因中具有潛在危害性的部分,例如某些病毒的致癌基因;
.如采用重組病毒系統(tǒng),例如痘苗病毒,易于制備同一載體的多價(jià)病毒疫苗;
可以生產(chǎn)目前尚無(wú)敏感細(xì)胞的病毒疫苗,例如乙型肝炎病毒表面抗原疫苗;
.生產(chǎn)成本可以大幅度降低;
年代以來,分子生物學(xué)有了飛躍的發(fā)展,新技術(shù)、新方法的應(yīng)用,使病毒學(xué)的研究煥然一新。在這一時(shí)期內(nèi)基本上弄清了DNARNA病毒的繁殖機(jī)理,發(fā)現(xiàn)了一類亞病毒,建立了許多病毒基因組的無(wú)性繁殖系;闡明了某些病毒的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系和一些病毒的基因表達(dá)調(diào)控原理;搞清了有48,502對(duì)核苷酸的λ噬菌體DNA的全結(jié)構(gòu)(Sanger et al 1982)以及許多動(dòng)物病毒基因組的一級(jí)結(jié)構(gòu),甚至具有十幾萬(wàn)對(duì)核苷酸的EB病毒基因組的序列分析也已完成(Epstein,個(gè)人通訊1984)。分子病毒學(xué)在理論上的迅速發(fā)展,給病毒性疾病的防治實(shí)踐帶來了新的突破。如果說,由受染動(dòng)物組織制備的病毒疫苗為第一代產(chǎn)品;由受染組織培養(yǎng)細(xì)胞制備的為第二代;那么,采用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的病毒疫苗則為第三代。目前,口蹄疫病毒基因工程疫苗在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),乙型肝炎病毒疫苗也已經(jīng)研制成功。DNA重組技術(shù)不僅更新了病毒疫苗,對(duì)預(yù)防病毒性疾病將做出重大的貢獻(xiàn);而且也使抗病毒治療發(fā)生了革命性的變化。例如,具有廣譜抗病毒活性的多肽物質(zhì)——干擾素,在我國(guó)也已經(jīng)可以采用基因工程技術(shù),由細(xì)菌發(fā)酵來生產(chǎn)(侯云德等19821983,1984)。DNA重組技術(shù)為生產(chǎn)新的多肽類藥物,開辟了一條新的途徑。
1892年ИBAHOCКИЙ發(fā)現(xiàn)病毒以來,病毒學(xué)在人類與病毒性疾病長(zhǎng)期斗爭(zhēng)的實(shí)踐中,已逐步發(fā)展成為在生物學(xué)界和醫(yī)學(xué)界中一門十分重要的學(xué)科。鑒于象乙型肝炎、流行性出血熱、病毒性腦炎、病毒性肺炎、流行性感冒等一些病毒性疾病在我國(guó)還比較嚴(yán)重,所以病毒學(xué)在我國(guó)衛(wèi)生保健事業(yè)中占有十分重要的地位。

 

 

 
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