亚洲成aⅴ人在线观看_亚洲欧美日韩综合一区在线观看_国产无码电影一区二区三区_国语精品91自产拍在线观看二区

VIP標(biāo)識(shí) 上網(wǎng)做生意,首選VIP會(huì)員| 設(shè)為首頁| 加入桌面| | 手機(jī)版| RSS訂閱
食品伙伴網(wǎng)服務(wù)號(hào)
 

SPA 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(SPA-ELISA)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

SPA-ELISA技術(shù)原理

SPA 能天然地與人及某些哺乳動(dòng)物的IgG分子上的Fc片段結(jié)合,一個(gè)分子的SPA可以同2個(gè)IgG分子以化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合(這不是真正的免疫反應(yīng),又稱為假免疫反應(yīng)),利用這個(gè)特性,以SPA代替IgG抗體而應(yīng)用于ELlSA中。


材料與試劑

1.SPA-HRP結(jié)合物,可向有關(guān)生物制品廠購買,也可自制,制法如下:

(1) 取5mg HRP(RZ=3.0)溶于1ml新配制的0.3mol/L pH8.1 NaHCO3液中。

(2) 加入0.1ml用無水乙醇配制的1%的1-熒光-2,4二硝基苯,室溫(20℃)溫和攪拌1h。

(3) 加入1ml0.16mol/L 乙二醇,室溫?cái)嚢?h。

(4) 以0.01mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液充分透析。

(5) 加入經(jīng)0.01mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液平衡的SPA 5mg/ml,于20℃溫和攪拌2h~3h。

(6) 加入5mg KBH4,混勻后,4℃放置3h。

(7) 以0.05mol/L pH 7.4 PBS透析過夜。

(8) 過Sephadex G100柱(100cm×2cm),以0.5mol/L pH7.4 PBS液洗脫,流速10ml/h。

(9) 測(cè)OD403nm,集SPA-HRP活性部分。

(10) 將高活性組分合并,加入甘油(含30%)置低溫保存。也可以采用過碘酸鈉法,制法如下:①5mg HRP溶于1ml新配制的0.3mol/L pH 8.1的NaHCO3液中;②加入無水乙醇配制1%1-熒光-2,4二硝基苯0.1ml,室溫混合1h;③加入1ml0.6mol/L NalO4(蒸餾水配制)室溫中混合30min;④加入1ml0.6mol/L乙烯乙二醇(蒸餾水配制),室溫緩慢混合1h;⑤以0.01mol/L pH9.6 NaHCO3緩沖液于4℃透析過夜;⑥加入透析液平衡的SPA液5mg/ml,室溫緩慢混合3h即可。

(11) SPA-HRP活性測(cè)定:①取豬血清IgG10μg/ml 0.1ml包被反應(yīng)板,4℃過夜,3×3min沖洗;②加入適量稀釋的SPA-HRP溶液0.1ml,置37℃2h,沖洗3×3min;③加入底物顯色,顯色的深淺應(yīng)與SPA-HRP的活性成正比。

2.稀釋液 0.05Mol/L pH7.4PBS液。

3.包被液 pH9.6碳酸鹽緩沖液。

4.洗滌液 0.02Mol/L7.4Tris-HCl緩沖液。

5.底物溶液 pH 5.6磷酸鹽-檸檬酸緩沖液:

0.2mo l/L Na2 HPO4(28.40g/L) 25.70ml

0.1mol/L 檸檬酸(19.20g/L) 24.30ml

H2O 50.00ml

用前加40mg鄰苯二胺,溶解后加30%H2O20.15ml。

6.終止液 2mol/L H2SO4 1滴。


操作方法

1.檢測(cè)抗體

⑴ 包被:用pH9.6碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋成50μg-100μg/ml,每孔加0.1ml,37℃感作2h后置4℃過夜。

⑵ 洗滌:以pH 7.4 Tris-HCl液洗滌3×3min。

⑶ 加樣:用pH 7.4PBS-Tween液稀釋被檢樣品,每孔0.1ml,37℃感作2h。

⑷ 洗滌3×3min。

⑸ 加SPA SPA經(jīng)pH7.4 PBS-Tween液稀釋后,每孔加入0.1ml,37℃30min。

⑹ 洗滌3×3min。

⑺ 加底物:每孔加底物0.1ml,置室溫15min(避光),再加2mol/L H2SO40.05ml(1滴)終止反應(yīng)。

2.檢測(cè)抗原

⑴ 包被:以抗體包被,此抗體必須用SPA不能結(jié)合的那些動(dòng)物的lgG,否則會(huì)因?yàn)镾PA同包被抗體結(jié)合而產(chǎn)生假陽性結(jié)果,包被條件同上。

⑵ 洗滌。

⑶ 加樣。

⑷ 洗滌。

⑸ 加抗體:此抗體必須選用能與SPA結(jié)合的動(dòng)物IgG,否則可因?yàn)镾PA不能同此層抗體結(jié)合而發(fā)生假陰性結(jié)果。

⑹ 洗滌。

⑺ 加SPA。

⑻ 洗滌。

⑼ 加底物及終止反應(yīng)。

3.檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)病毒抗原

⑴ 蓋玻片培養(yǎng)單層細(xì)胞。

⑵ 接種易感病毒。

⑶ 用甲醇固定細(xì)胞。

⑷ 加抗血清于蓋玻片上,37℃孵育1h。Tris-HCl液3×3min洗滌。

⑸ 將PPA滴加在蓋玻片上,37℃孵育30min。

⑹ 洗滌3×3min。

⑺ 將蓋玻片置底物溶液中,室溫15min。

⑻ 以pH7.4 Tris-HCl液稍加沖洗后即可鏡檢。


結(jié)果判定

1.檢測(cè)抗體或抗原

⑴ 眼觀判定:在對(duì)照組成立的前提下,和標(biāo)準(zhǔn)陽性孔相近顏色者,均判為陽性(+)。

⑵ 酶標(biāo)儀測(cè)定:以空白對(duì)照孔調(diào)零,標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品校正至某一規(guī)定值,測(cè)定待測(cè)孔,當(dāng)待測(cè)孔OD值或計(jì)算值達(dá)某一規(guī)定閾值時(shí),判為陽性。

2.檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)抗原 鏡下觀察,凡細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒者,判為陽性。


注意事項(xiàng)

1.目前使用的聚苯乙烯塑料板對(duì)抗體的吸附性能較好,,因此對(duì)于抗原,特別是大分子(分子量>100萬)的抗原應(yīng)該進(jìn)行一些適當(dāng)?shù)奶幚?如DNA,應(yīng)將其事先凍融,使其變成較小分子再包被,如脂蛋白則應(yīng)改變包被的溫度,可在37℃包被過夜。

2.由于SPA-ELISA的敏感性極高,因此也很容易出現(xiàn)非特異性顯色,排除非特異性顯色的方法除了純化抗原抗體外,還應(yīng)該注意:

⑴抗原包被后,再以牛血清白蛋白包被一次或稀釋液中加入1%的牛血清白蛋白均可,以占據(jù)未包被的一些空隙。

⑵檢測(cè)血清抗體時(shí),需事先檢測(cè)大標(biāo)本量的正常血清效價(jià)水平,在檢測(cè)待檢標(biāo)本時(shí),減去正常的血清效價(jià)。

⑶ELISA法加入標(biāo)記物后往往37℃孵育2h,SPA同IgG的結(jié)合不是免疫反應(yīng),而是一種化學(xué)反應(yīng),一般認(rèn)為,這種結(jié)合可能在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生,所以加PPA后,孵育時(shí)間可以縮短到0.5h。孵育過久,反而可因?yàn)镾PA本身吸附到反應(yīng)板上,造成非特異性顯色。

3.疊氮鈉對(duì)SPA顯色影響較大,所以在SPA-ELISA過程中,不宜加疊氮鈉做防腐劑,在組織細(xì)胞培養(yǎng)固定,也不適宜用甲醛固定,而需采取甲醇或乙醇。

 

 

 
推薦圖文
推薦食品專題
點(diǎn)擊排行
 
 
Processed in 0.467 second(s), 18 queries, Memory 0.88 M