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酶免疫電鏡

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

原理

酶免疫電鏡技術(shù)是利用酶的高效率的催化作用對(duì)其底物的反應(yīng)形成不同的電子密度,借助于電子顯微鏡觀察,證明酶的存在,從而對(duì)抗原進(jìn)行定位。


材料與試劑

1.PBS液 取NaCl 8.5g,Na2HPO40.85g,KH2PO40.54g,加水至1 000ml即可。

2.DAB溶液 取5mgDAB(3、3二氨基聯(lián)苯胺)加入10mlTris-HCl緩沖液(0.05mMol/L pH 7.6),加1%H2O20.5ml~1ml。配制時(shí),避光進(jìn)行,現(xiàn)用現(xiàn)配。在顯色完成沖洗過(guò)程中,要保持流水沖洗,防止非特異性物質(zhì)積于標(biāo)本上。

3.戊二醛固定液 取50ml 0.2Mol/L PBS緩沖液與25%戊二醛按以下比例配制:

0.2Mol/LPBS液 50 50 50 50 50

25%戊二醛(ml) 4 6 8 10 12

重蒸餾水(ml) 46 44 42 40 28

固定液終濃度(%) 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0


操作方法

1.酶標(biāo)抗體的制備

2.取材 將培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮細(xì)胞用0.1Mol/L PBS液沖洗,離心沉淀后,立即轉(zhuǎn)入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2,4℃固定5min~30min(依抗原性質(zhì)所定)。如病料為組織塊,則取適當(dāng)大小,先固定1h然后取出,以新的雙面刀片切成50~100µm的薄組織再行固定1h~2h。

3.漂洗 以PBS液漂洗過(guò)夜,換液3~4次。

4.血清孵育,25℃1h或4℃過(guò)夜,孵育的標(biāo)本放置于加蓋的瓷盤內(nèi),底層墊數(shù)層紗布。防止抗血清干燥凝固,不易洗脫,造成非特異性吸附。

5.PBS沖洗3~4次,每次10min。

6.2.5%戊二醛再固定15min~30min。

7.PBS液沖洗3~4次每次10min。

8.酶標(biāo)記抗體孵育;用適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體(即工作濃度)于25℃濕盆內(nèi)孵育1h或4℃過(guò)夜。

9.PBS液沖洗3~4次每次10min或4℃漂洗過(guò)夜。

10.酶顯色處理 將漂洗后的標(biāo)本浸入DAB-H2O2底物溶液中,20℃,10min~30min。顯色強(qiáng)弱與戊二醛的固定有關(guān)。若顯色弱則可減少甚至取消戊二醛的固定時(shí)間。沖洗時(shí)必須注意防止非特異漂浮的沉積。

11.常規(guī)包埋、切片、電鏡觀察 在經(jīng)過(guò)脫水包埋確定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色,切片一般在2µm~4µm,切片后染色不存在通透困難的問(wèn)題。無(wú)論在標(biāo)記染色后切片還是在切片后標(biāo)記染色,最好在光鏡下定位選擇后,再做電鏡定位包埋,這樣目的性強(qiáng),可減少工作量。


結(jié)果判定

在已知陽(yáng)性、陰性樣品成立的前提下,凡出現(xiàn)棕色顆粒,即指示抗原抗體的存在,同時(shí)可觀察到病毒顆粒的存在,判為陽(yáng)性(+),否則判為陰性(-)。

 

 

 
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