原理

酶免疫電鏡技術(shù)是利用酶的高效率的催化作用對(duì)其底物的反應(yīng)形成不同的電子密度，借助于電子顯微鏡觀察，證明酶的存在，從而對(duì)抗原進(jìn)行定位。

材料與試劑

1．PBS液 取NaCl 8.5g，Na2HPO40.85g，KH2PO40.54g，加水至1 000ml即可。

2．DAB溶液 取5mgDAB(3、3二氨基聯(lián)苯胺)加入10mlTris－HCl緩沖液(0.05mMol/L pH 7.6)，加1%H2O20.5ml～1ml。配制時(shí)，避光進(jìn)行，現(xiàn)用現(xiàn)配。在顯色完成沖洗過(guò)程中，要保持流水沖洗，防止非特異性物質(zhì)積于標(biāo)本上。

3．戊二醛固定液 取50ml 0.2Mol/L PBS緩沖液與25%戊二醛按以下比例配制：

0.2Mol/LPBS液 50 50 50 50 50

25%戊二醛（ml） 4 6 8 10 12

重蒸餾水（ml） 46 44 42 40 28

固定液終濃度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

操作方法

1．酶標(biāo)抗體的制備

2．取材 將培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮細(xì)胞用0.1Mol/L PBS液沖洗，離心沉淀后，立即轉(zhuǎn)入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2，4℃固定5min～30min(依抗原性質(zhì)所定)。如病料為組織塊，則取適當(dāng)大小，先固定1h然后取出，以新的雙面刀片切成50～100µm的薄組織再行固定1h～2h。

3．漂洗 以PBS液漂洗過(guò)夜，換液3～4次。

4．血清孵育，25℃1h或4℃過(guò)夜，孵育的標(biāo)本放置于加蓋的瓷盤內(nèi)，底層墊數(shù)層紗布。防止抗血清干燥凝固，不易洗脫，造成非特異性吸附。

5．PBS沖洗3～4次，每次10min。

6．2.5%戊二醛再固定15min～30min。

7．PBS液沖洗3～4次每次10min。

8．酶標(biāo)記抗體孵育；用適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體(即工作濃度)于25℃濕盆內(nèi)孵育1h或4℃過(guò)夜。

9．PBS液沖洗3～4次每次10min或4℃漂洗過(guò)夜。

10．酶顯色處理 將漂洗后的標(biāo)本浸入DAB－H2O2底物溶液中，20℃，10min～30min。顯色強(qiáng)弱與戊二醛的固定有關(guān)。若顯色弱則可減少甚至取消戊二醛的固定時(shí)間。沖洗時(shí)必須注意防止非特異漂浮的沉積。

11．常規(guī)包埋、切片、電鏡觀察 在經(jīng)過(guò)脫水包埋確定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色，切片一般在2µm～4µm，切片后染色不存在通透困難的問(wèn)題。無(wú)論在標(biāo)記染色后切片還是在切片后標(biāo)記染色，最好在光鏡下定位選擇后，再做電鏡定位包埋，這樣目的性強(qiáng)，可減少工作量。

結(jié)果判定

在已知陽(yáng)性、陰性樣品成立的前提下，凡出現(xiàn)棕色顆粒，即指示抗原抗體的存在，同時(shí)可觀察到病毒顆粒的存在，判為陽(yáng)性(＋)，否則判為陰性(－)。