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酶標記方法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

交聯(lián)法

交聯(lián)法通常用的交聯(lián)劑是戊二醛,戊二醛商品大多為25%的水溶液,利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基,分別與酶和蛋白質(zhì)分子中游離的氨基、酚基等以共價鍵結(jié)合而進行標記。標記時應盡量采用新鮮純品,當戌二醛的OD235nm/OD280nm3時,即為好的交聯(lián)劑。

戊二醛交聯(lián)法又分為一步法和二步法。

一步法:即把酶、戊二醛和抗體一起加入進行交聯(lián)。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結(jié)合物。由于抗體分子量大(16),酶分子量小(4),抗體分子的氨基數(shù)比酶蛋白分子氨基數(shù)多得多,結(jié)果生成的抗體-戊二醛或抗體-戊二醛-抗體多而造成酶標物的活性小。一步法操作:①抗IgGAKP的制備:將10mgAKP溶于含有5mgIgG1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中,在冰浴中緩緩攪拌,盡量避免氣泡產(chǎn)生,完全溶解后,緩緩滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的最終濃度為0.2%,移至室溫中靜置2h~3h后,以0.01Mol/L pH7.0 PBS4充分透析或以SephadexG25柱除去過量的戊二醛,4保存?zhèn)溆?/span>(也可保存于50%甘油中置低溫冰箱);②抗IgGHRP的制備:將12mgHRP溶于含5mgIgG1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8),緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4mL,置室溫2h~3h,充分透析或以SephadexG25除戊二醛,小量分裝后保存于低溫冰箱,避免反復凍融;蚶鋬龈稍锉4妗

二步法:是先使酶與戊二醛反應,除去未反應的戊二醛,再使已“活化”的酶分子與抗體分子的氨基結(jié)合,最后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基。二步法操作:將10mg的酶溶于0.2ml1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室溫放置18h,充分透析或以SephadexG25柱除去未反應的戊二醛。加生理鹽水至1ml然后加入1ml(5mg)的抗體溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液,混合后4冰箱放置24h,加入0.1ml 0.2mol/L賴氨酸,置室溫2h,以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析,離心去沉淀,上清液即為酶結(jié)合物,再進一步以硫酸銨沉淀純化后應用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。

改良HRP二步標記法:取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液中,加入25%戊二醛0.1ml,37溫育2h后加入冰冷的分析純的無水乙醇2ml2 500r/min離心沉淀10min~15min,傾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混懸,同上離心,傾去乙醇,將管倒置,使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液溶解,加入0.5ml~1ml IgG抗體溶液(含抗體15mg左右),放在冰箱內(nèi)過夜后,加KH2 PO4,使近中性即可應用。

氧化法

采用過碘酸鈉,過碘酸鈉是強氧化劑,能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無關(guān)的部分)的羥基氧化成醛基,然后與抗體的氨基結(jié)合,形成酶標抗體。

1)氧化法操作過程如下:將5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸鈉中,加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)無水乙醇溶液,在室溫中混合后,再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L過碘酸鈉(NaIO4),置室溫中輕攪30min,在溶液呈黃綠色時,加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液,在室溫中放置1h,使氧化反應中止,然后在40.10Mol/L pH 9.5重碳酸鈉緩沖液透析,換液3次。在3ml HRP-醛基溶液中,加入5mg(溶于1ml的碳酸鹽緩沖液中),室溫置2h~3h,加入5mg氫化硼鈉(NaBH4),于4冰箱放置3h或過夜,然后用PBS液充分透析,離心去沉淀物。上清液即為酶結(jié)合物,純化后使用。

2)改良過碘酸鈉法:①取5mg HRP溶于0.5ml雙餾水中,加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml雙餾水+128mg NaIO4) 0.5ml,混勻,置430min;② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O 0.09ml乙二醇)0.5ml,室溫放置30min;③加入含5mg純化抗體的水溶液1ml,混勻,并裝入透析袋,對0.05Mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析6h(或過夜),使之結(jié)合;④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml,混勻,置42h;⑤在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液,混勻,430min,離心,去上清,沉淀以少許0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解,裝入透析袋,以同樣液體在4透析除鹽過夜;⑥次日取出離心,以除去不溶物,即得酶-抗體(HRPIgG)結(jié)合物,以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;⑦效價測定合格后,加入等量優(yōu)質(zhì)甘油,分裝小瓶,低溫保存。

戊二醛法與過碘酸鈉法比較

比較項目

戊二醛法

過碘酸鈉法

一步法

二步法

標記方法

簡單

較復雜

較復雜

酶利用率

24%

24%

70%酶偶聯(lián)到99%抗體上

產(chǎn)率

5%

5%

50%

標記抗體分子量

750

25

40

穿入組織能力

一般

抗體活性丟失

較多

酶活性丟失

較多

染色效應

較好

較好

二馬來酰亞胺法

二馬來酰亞胺(Dimaleimide)能與蛋白質(zhì)半胱氨酸的硫基反應。首先用α-巰基乙胺還原蛋白質(zhì)(IgG),并用NN-O-苯二馬來酰亞胺活化,然后除去多余的試劑,最后使含二馬來酰IgG與含硫基的β-半乳糖苷酶連接。具體操作如下:將抗lgG抗體溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸鈉緩沖液并對同一緩沖液透析平衡過夜,離心除去不溶性物質(zhì),IgG(14mg/2ml)10mlα-巰基乙胺在37溫育90min。過Sephadex后濃縮使每ml3.0mg左右的還原抗IgG。在0,11滴加飽和N、NO-苯二馬來酰亞胺溶液,混合,于30溫育20min,過SephadexG25柱,除去未反應的二馬來酰亞胺。收集二馬來酰亞胺“活化”的抗IgG,濃縮使?jié)舛葹?/span>OD280nm=1.0(光徑1cm),1ml溶液加20μl(5mg/ml)β-半乳糖苷酶,置3020min,用0.10Mol/L NaOH中和后,于424h~72h,再過Sepharose-6B(1.5×40cm),以pH7.0PBS洗脫,收集酶結(jié)合物,加疊氮鈉(NaN3)防腐,4保存?zhèn)溆谩?/span>

 

 

 

 
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