脾細胞

1．材料

(1) 免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠。

(2) 1640培養(yǎng)液

(3) 2.5％FCS－1640營養(yǎng)液

2．操作方法

(1) 拉頸或用CO2處死小白鼠。

(2) 將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無菌條件下取脾。

(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。

(4) 用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細胞懸液，用毛細管將懸液移入小試管中。

(5) 直立小試管3min，使大塊的結締組織下沉，把細胞懸液移入離心管中。

(6) 以2.5％FCS—1640充滿離心管，并以400g離心7min～10min（與此同時應開始制備骨髓細胞）。

(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。

(8) 重復⑹、⑺步驟。

(9) 計算細胞，以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細胞數應高于80％為合格。

骨髓瘤細胞

骨髓瘤細胞能產生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞。

選擇骨髓瘤細胞的條件：①該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細胞必須是靜息狀態(tài)，不產生γ球蛋白或不分泌到細胞外；③骨髓瘤細胞生長需要一個較高的細胞密度,最好106個細胞/ml；④生長速度快，繁殖時間短。

目前常用的Balb/c小鼠產生的骨髓瘤細胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（簡稱SP2）；③P2—X？ ­—Ag8·6·5·3（簡稱653）；④FO

以653最為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）誘發(fā)出來的一種漿細胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并經過培育形成一株8-氮鳥嘌呤有抵抗力的亞系。

骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，試驗時復蘇、增殖、傳代即可。

由于骨髓瘤細胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要胰酶處理。為了防止出現返祖現象，在融合前，可將培養(yǎng)基內加入15μg/ml 8－氮鳥嘌呤。取約1×107～6×107對數生長期（即培養(yǎng)15h～20h）的骨髓瘤細胞，在室溫離心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再懸浮并計數。

飼養(yǎng)細胞

在體外的細胞培養(yǎng)中，單個的或數量很少的細胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細胞才能使其生長繁殖，加入的細胞稱之為飼養(yǎng)細胞（Feeder cell）。在細胞融合和單克隆的選擇過程中，就是在少量的或單個細胞的基礎上使其生長繁殖成群體，因此在這一過程中必須使用飼養(yǎng)細胞。許多種類的動物細胞都可以做飼養(yǎng)細胞，如正常的脾細胞、胸腺細胞、腹腔滲出細胞等，常選用腹腔滲出細胞，其中主要是巨噬細胞和淋巴細胞。應用腹腔滲出細胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細胞，另一方面巨噬細胞可以吞噬死亡的細胞和細胞碎片，為融合細胞的生長造成良好的環(huán)境。腹腔細胞的來源可以是與骨髓瘤細胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。

1．材料

（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。

（2）11.6％蔗糖溶液（經10磅30min高壓滅菌）。

2．操作方法

（1）拉頸處死小鼠。

（2）70％酒精浸泡消毒10min。

（3）用手術剪將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚，露出腹腔。

（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。

（5）1 000r／min離心10min。

（6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細胞制成懸液。臺盼藍染色計數活細胞，使每毫升含40萬個活細胞。

（7）以1ml吸管將細胞種入微量培養(yǎng)皿，每孔0.05ml，含2萬個細胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可供細胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細胞數量少，則可以在細胞換液時再加入一些。