溶血空斑形成試驗(yàn)是一種體外檢測(cè)單個(gè)抗體形成細(xì)胞(漿細(xì)胞)的方法，故又稱體外抗體形成細(xì)胞(Plaque Forming Cell, PFC)測(cè)定技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)不僅可以作為免疫基本理論研究的有力工具，廣泛地用于檢測(cè)產(chǎn)生IgM類型(包括其它各類免疫球蛋白及其亞類)的抗體形成細(xì)胞，它還可作為臨床篩選抗腫瘤新藥以及研究中藥對(duì)抗體免疫功能影響的免疫學(xué)指標(biāo)。
一、原理：
溶血空斑形成試驗(yàn)的基本原理是將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠的脾細(xì)胞與一定量的綿羊紅細(xì)胞混合，在補(bǔ)體參與下，使抗體形成細(xì)胞周圍那些受到抗體分子致敏的綿羊紅細(xì)胞溶解，形成肉眼可見(jiàn)的溶血空斑。根據(jù)所操作的方法不同可分為直接溶血空斑試驗(yàn)，間接溶血空斑試驗(yàn)，瓊脂固相法，小室液相法，單細(xì)胞層法等等。下面介紹直接溶血空斑形成試驗(yàn)。
二、操作步驟：
1. 底層瓊脂平皿的制備：將1.4％瓊脂加熱融化后傾注于平皿內(nèi)，每個(gè)平皿6ml，凝固后置濕盒37℃?zhèn)溆谩?br />2. 0.7％瓊脂加熱融化后加入華氏管內(nèi)，每管2ml，47～49℃水浴保溫備用。
3. 免疫小鼠脾細(xì)胞懸液制備：用4×10３ 個(gè)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)鹽水懸液腹腔免疫小鼠，對(duì)照為等量生理鹽水。4天后，小鼠拉脫頸椎處死，取出脾臟，用RPMI164。洗一次后置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上,用注射器針芯研磨成懸液,洗滌兩次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3～8×10６/ml。臺(tái)盼蘭染色查活細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于90％。置4℃冰箱備用。
4. 試驗(yàn)平皿的制備：依次將預(yù)溫40℃左右的25％SRBC、牼-SRBC吸收的滅活胎牛血清以及保存于4℃的脾細(xì)胞懸液各0.1ml加入預(yù)熱47～49℃的含0.7％瓊脂的華氏管中，迅速混勻，立即傾注于鋪有底層瓊脂的平皿內(nèi)，凝固后，置37℃孵育1小時(shí)。
5. 加入1∶5～1∶10稀釋的新鮮豚鼠血清0.5～1.0ml，使其均勻覆蓋表面,再次置37℃溫育30分鐘，即可用肉眼或借助于放大鏡進(jìn)行空斑計(jì)數(shù)。
三、試劑和器材
㈠ 試劑
1. 1.4％瓊脂：用pH7.4PBS配制。
2. 0.7％瓊脂：用pH7.4PBS配制
3. 25％SRBC鹽水懸液
4. RPMI1640
5. 胎牛血清，56℃30分鐘滅活，并經(jīng)SRBC吸收
6. 補(bǔ)體：新鮮豚鼠血清，用前經(jīng)SRBC吸收后，用RPMI1640稀釋。
�、� 器材：玻璃平皿7×1.5cm，三角燒瓶，水浴箱(47～49℃)，華氏管，1ml注射器，不銹鋼篩網(wǎng)，青霉素瓶，離心管，不同規(guī)格加樣器等。
四、注意事項(xiàng)：
1. 0.7％瓊脂必須置47～49℃水浴融態(tài)保溫。如溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致SRBC溶血或所加入脾細(xì)胞的死亡。溫度過(guò)低則在操作過(guò)程中瓊脂發(fā)生凝固，影響上層瓊脂平板的制備
2. 離體的脾細(xì)胞應(yīng)置4℃冰箱保存，防止抗體分泌和細(xì)胞死亡。
3. 在制備試驗(yàn)平皿時(shí)，對(duì)于所有玻璃器皿和各種試劑，均需預(yù)溫，牭1各種試劑加入華氏管后，應(yīng)與0.7％瓊脂迅速充分混勻，然后立即傾倒于底層瓊脂上，并避免傾入氣泡。
4. 加入的補(bǔ)體應(yīng)均勻覆蓋于表層瓊脂上。
5. 制備底層平皿和試驗(yàn)平皿時(shí)，均須將平皿置于水平臺(tái)上，以保證瓊脂面鋪平。
一、原理：
溶血空斑形成試驗(yàn)的基本原理是將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠的脾細(xì)胞與一定量的綿羊紅細(xì)胞混合，在補(bǔ)體參與下，使抗體形成細(xì)胞周圍那些受到抗體分子致敏的綿羊紅細(xì)胞溶解，形成肉眼可見(jiàn)的溶血空斑。根據(jù)所操作的方法不同可分為直接溶血空斑試驗(yàn)，間接溶血空斑試驗(yàn)，瓊脂固相法，小室液相法，單細(xì)胞層法等等。下面介紹直接溶血空斑形成試驗(yàn)。
二、操作步驟：
1. 底層瓊脂平皿的制備：將1.4％瓊脂加熱融化后傾注于平皿內(nèi)，每個(gè)平皿6ml，凝固后置濕盒37℃?zhèn)溆谩?br />2. 0.7％瓊脂加熱融化后加入華氏管內(nèi)，每管2ml，47～49℃水浴保溫備用。
3. 免疫小鼠脾細(xì)胞懸液制備：用4×10３ 個(gè)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)鹽水懸液腹腔免疫小鼠，對(duì)照為等量生理鹽水。4天后，小鼠拉脫頸椎處死，取出脾臟，用RPMI164。洗一次后置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上,用注射器針芯研磨成懸液,洗滌兩次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3～8×10６/ml。臺(tái)盼蘭染色查活細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于90％。置4℃冰箱備用。
4. 試驗(yàn)平皿的制備：依次將預(yù)溫40℃左右的25％SRBC、牼-SRBC吸收的滅活胎牛血清以及保存于4℃的脾細(xì)胞懸液各0.1ml加入預(yù)熱47～49℃的含0.7％瓊脂的華氏管中，迅速混勻，立即傾注于鋪有底層瓊脂的平皿內(nèi)，凝固后，置37℃孵育1小時(shí)。
5. 加入1∶5～1∶10稀釋的新鮮豚鼠血清0.5～1.0ml，使其均勻覆蓋表面,再次置37℃溫育30分鐘，即可用肉眼或借助于放大鏡進(jìn)行空斑計(jì)數(shù)。
三、試劑和器材
㈠ 試劑
1. 1.4％瓊脂：用pH7.4PBS配制。
2. 0.7％瓊脂：用pH7.4PBS配制
3. 25％SRBC鹽水懸液
4. RPMI1640
5. 胎牛血清，56℃30分鐘滅活，并經(jīng)SRBC吸收
6. 補(bǔ)體：新鮮豚鼠血清，用前經(jīng)SRBC吸收后，用RPMI1640稀釋。
�、� 器材：玻璃平皿7×1.5cm，三角燒瓶，水浴箱(47～49℃)，華氏管，1ml注射器，不銹鋼篩網(wǎng)，青霉素瓶，離心管，不同規(guī)格加樣器等。
四、注意事項(xiàng)：
1. 0.7％瓊脂必須置47～49℃水浴融態(tài)保溫。如溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致SRBC溶血或所加入脾細(xì)胞的死亡。溫度過(guò)低則在操作過(guò)程中瓊脂發(fā)生凝固，影響上層瓊脂平板的制備
2. 離體的脾細(xì)胞應(yīng)置4℃冰箱保存，防止抗體分泌和細(xì)胞死亡。
3. 在制備試驗(yàn)平皿時(shí)，對(duì)于所有玻璃器皿和各種試劑，均需預(yù)溫，牭1各種試劑加入華氏管后，應(yīng)與0.7％瓊脂迅速充分混勻，然后立即傾倒于底層瓊脂上，并避免傾入氣泡。
4. 加入的補(bǔ)體應(yīng)均勻覆蓋于表層瓊脂上。
5. 制備底層平皿和試驗(yàn)平皿時(shí)，均須將平皿置于水平臺(tái)上，以保證瓊脂面鋪平。