1、 選取7~8周齡雌性小鼠,陰道口封閉,作為供體,下午3:00左右,每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小時后,每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU),并與正常公鼠合籠;另取數(shù)只適齡母鼠(2月齡以上)作為受體,陰道口潮紅,與結(jié)扎公鼠合籠。
3、第二天上午9:00前觀察供體、受體,有精栓者拿出備用。受體籠拿出作好隔離措施。
4、10:30左右,斷頸處死供體,手術(shù)取出整個輸卵管,放入透明質(zhì)酸酶~0.3mg/M2液中。顯微鏡下,用鑷子撕開輸卵管壺腹部,受精卵隨同顆粒細胞即一同流出。
5、仔細觀察放在透明質(zhì)酸酶M2液中的受精卵,當受精卵周圍的顆粒細胞脫離時,將受精卵吸出,放入M2液中洗滌,最后放在M16液中放入5% CO2,37C0培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
6、在顯微鏡下觀察,挑選細胞飽滿,透明帶清晰,雄原核清晰可見的受精卵待用。
7、安裝持卵針和注射針,使其末端平行于載物臺,在凹玻片的中央滴入一滴M2液,覆蓋石蠟油,移入待注射的受精卵。DNA在注射針中的氣泡應(yīng)在先前全部彈走。
8、在高倍鏡下,將注射針輕觸持卵管,使DNA緩慢流出并控制其流量;反復(fù)吹吸受精卵,使其處于最佳位置,將注射針刺入受精卵的雄原核,直至看到原核膨大即退出。將注射過的和未注射過的受精卵上下分開放置,不致于混攪,注射完畢后,放入5% CO2,37C0培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
9、將受體麻醉,注射計量為1%戊巴比妥鈉0.01ml/g,腹腔注射。手術(shù)取出卵巢連接輸卵管,用脂肪鑷固定,在顯微鏡下找到輸卵管開口。吸取注射后經(jīng)培養(yǎng)成活的受精卵,吸取方法是先吸一段較長的M2,吸一個氣泡,然后吸取受精卵,盡量緊密排列,再吸一段液體,吸一個氣泡,再吸一段液體,共四段液體三個氣泡。除較長的那段液體,其余的液體大致1cm左右,氣泡0.2cm左右。將移植管口插入輸卵管口,輕輕將移植管內(nèi)的液體吹入,看到輸卵管壺腹部膨大并清晰地看到三個氣泡,即移植成功。將卵巢連同輸卵管放回腹腔,縫合肌肉和皮膚。
10、受體每隔一個星期稱體重一次,當?shù)诙伪鹊谝淮畏Q重增加時,即可初步判斷懷孕。手術(shù)后19~21天仔鼠分娩,待仔鼠3周后,剪耳、編號,剪尾,交分子組檢測。
(一般選取4-5周齡的雌鼠作為供體,此時的小鼠卵數(shù)較多,狀態(tài)較好。用pms誘導(dǎo)卵細胞成熟,用hcg超排。)