大多植物病毒RNA為單鏈RNA,并且其極性與mRNA極性相同,植物病毒RNA提取較為簡(jiǎn)單,一般使用酚氯仿即可獲得滿意結(jié)果。
一、材料
提純TMV病毒液(10mg/ml)。
二、設(shè)備
冷凍臺(tái)式離心機(jī),低溫真空干燥儀,電泳儀,電泳槽。
三、試劑
TE-飽和酚:氯仿(1:1),氯仿,3M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE緩沖液,無RNA酶的雙菌水。
四、操作步驟
1、取一eppendorf管加入提純TMV(10mg/ml)400ml,再加入等體積酚/氯仿,蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘,4℃下12000g離心10分鐘。
2、吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有機(jī)相交界面無蛋白為止。
3、吸取水相于新eppendorf心管,加入等體積氯仿,用手倒置離心管數(shù)十秒,4℃下12000g離心10分鐘。
4、取水相,加入1/10倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍體積的冰冷乙醇,混勻,-20℃30分鐘。
5、4℃下12000g離心15分鐘,小心棄去上清液,用70%乙醇洗滌沉淀,4℃下12000g離心5分鐘。
6、小心棄去上清液,沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘,并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。
7、取10ml進(jìn)行電泳分析,另10ml用于cDNA合成。
[注意] 1、整個(gè)操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。
2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面,因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍,一般需要多次進(jìn)行酚/氯仿的抽提。
一、材料
提純TMV病毒液(10mg/ml)。
二、設(shè)備
冷凍臺(tái)式離心機(jī),低溫真空干燥儀,電泳儀,電泳槽。
三、試劑
TE-飽和酚:氯仿(1:1),氯仿,3M NaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE緩沖液,無RNA酶的雙菌水。
四、操作步驟
1、取一eppendorf管加入提純TMV(10mg/ml)400ml,再加入等體積酚/氯仿,蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘,4℃下12000g離心10分鐘。
2、吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有機(jī)相交界面無蛋白為止。
3、吸取水相于新eppendorf心管,加入等體積氯仿,用手倒置離心管數(shù)十秒,4℃下12000g離心10分鐘。
4、取水相,加入1/10倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2),2.5倍體積的冰冷乙醇,混勻,-20℃30分鐘。
5、4℃下12000g離心15分鐘,小心棄去上清液,用70%乙醇洗滌沉淀,4℃下12000g離心5分鐘。
6、小心棄去上清液,沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘,并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。
7、取10ml進(jìn)行電泳分析,另10ml用于cDNA合成。
[注意] 1、整個(gè)操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。
2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面,因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍,一般需要多次進(jìn)行酚/氯仿的抽提。