分為六個(gè)階段:
階段1:反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈
階段2:cDNA第二鏈的合成
階段3:cDNA的甲基化
階段4:接頭或銜接子的連接
階段5:Sepharose CL-4B凝膠過(guò)濾法分離cDNA
階段6:cDNA與λ噬菌體臂的連接
[階段1:反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈]
1.在置于冰上的無(wú)菌微量離心管內(nèi)混合下列試劑進(jìn)行cDNA第一鏈的合成:
poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl
寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl
1mol/L Tris-HCl (pH8.0,
1mol/L KCl 3.5μl
250 mmol/L MgCl2 2μl
dNTP溶液(含4種dNTP,每種5mmol/L) 10μl
0.1 mol/L DTT 2μl
RNase抑制劑(選用) 25單位
加H2O至 48μl
2.當(dāng)所有反應(yīng)組在
3.大規(guī)模和小規(guī)模反應(yīng)管都在
4.溫育接近結(jié)束時(shí),在含有同位素的小規(guī)模反應(yīng)管中加入1μl 0.25mol/L EDTA,然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到冰上。大規(guī)模反應(yīng)管則在
5.參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版附錄8所述方法,測(cè)定0.5μl小規(guī)模反應(yīng)物中放射性總活度和可被三氯乙酸(TCA)沉淀的放射性活度。此外,用合適的DNA分子質(zhì)量參照物通過(guò)堿性瓊脂糖凝膠電泳對(duì)小規(guī)模反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析是值得的。
6.按下述方法計(jì)算cDNA第一鏈的合成量(推算方法略):
[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一鏈(μg)
7.盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一步驟。
[階段2:cDNA第二鏈的合成]
1.將下列試劑直接加入大規(guī)模第一鏈反應(yīng)混合物中:
10 mmol/L MgCl2 70μl
2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl
10 mCi/ml[α-32P] dCTP(400 Ci/mmol) 10μl
1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl
RNase H (1000單位/ml) 1μl
大腸桿菌DNA聚合酶I (10 000單位/ml) 4.5μl
溫和振蕩將上述試劑混合,在微量離心機(jī)稍離心,以除去所有氣泡。在
2.溫育結(jié)束,將下列試劑加到反應(yīng)混合物中:
β-NAD (50 mmol/L) 1μl
大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml) 1μl
室溫溫育15min。
3.溫育結(jié)束,加入1μl含有4種dNTP的混合物和2μl T4噬菌體DNA聚合酶。反應(yīng)混合物室溫溫育15分鐘。
4.取出3μl反應(yīng)物,按步驟7和8描述的方法測(cè)定第二鏈DNA的質(zhì)量。
5.將5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反應(yīng)物中,用酚:氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下,通過(guò)乙醇沉淀回收DNA,將DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。
6.將下列試劑加到DNA溶液中:
10×T4多核苷酸激酶緩沖液 10μl
T4多核苷酸激酶(3000單位/ml) 1μl
室溫溫育15分鐘。
7.測(cè)定從上面步驟4取出的3μl反應(yīng)物中放射性活度,并按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版附錄8所述方法測(cè)定1μl第二鏈合成產(chǎn)物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8.用下面公式計(jì)算第二鏈反應(yīng)中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNA第一鏈種的dNTP的量。
[第二鏈反應(yīng)中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA第二鏈合成量/μg
x表示cDNA第一鏈量。CDNA第二鏈合成量通常為第一鏈量的70~80%
9.用等量酚:氯仿對(duì)含有磷酸化cDNA(來(lái)自步驟6)的反應(yīng)物進(jìn)行抽提。
10. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進(jìn)行平衡,然后通過(guò)離子柱層析將未摻入的dNTP和cDNA分開(kāi)。
11. 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和2倍體積的乙醇,沉淀柱層析洗脫下來(lái)的cDNA,將樣品置于冰上至少15分鐘,然后在微量離心機(jī)上以最大速度
12. 用70%乙醇洗滌沉淀物,重復(fù)離心。
13. 小心吸出所有液體,空氣干燥沉淀物。
14. 如果需要用EcoR I甲基化酶對(duì)cDNA進(jìn)行甲基化,可將cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中。另外,如果要將cDNA直接與Not I或Sal I接頭或寡核苷酸銜接子相連,可將cDNA懸浮在29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后,盡快進(jìn)行cDNA合成的下一步驟。
[階段3:cDNA的甲基化]
1.在cDNA樣品中加入以下試劑:
2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl
5 mol/L NaCl 2μl
0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 1μl
加H2O至 96μl
2.取出兩小份樣品(各2μl)至0.5ml微量離心管中,分別編為1號(hào)和2號(hào),置于冰上。
3.在余下的反應(yīng)混合液中加入2μl EcoR I 甲基化酶(80 000單位/ml),保存在
4.再?gòu)拇篌w積的反應(yīng)液中吸出另外兩小分樣品(各2μl)至0.5ml微量離心管中,分別編為3號(hào)和4號(hào)。
5.在所有四小份樣品(來(lái)自步驟2和步驟4)加入100 ng質(zhì)粒DNA或500 ng的λ噬菌體DNA。這些未甲基化的DNA在預(yù)實(shí)驗(yàn)中用作底物以測(cè)定甲基化效率。
6.所有四份小樣實(shí)驗(yàn)反應(yīng)和大體積的反應(yīng)均在
7.于
8.在大體積反應(yīng)液中加入0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉(pH5.2)和2倍體積的乙醇,混勻后貯存于
9.按下述方法分析4個(gè)小樣對(duì)照反應(yīng):
a. 在每一對(duì)照反應(yīng)中分別加入:
0.1 mol/L MgCl2 2μl
10×EcoR I 緩沖液 2μl
加H2O至 20μl
b. 在2號(hào)和4號(hào)反應(yīng)管中分別加入20單位EcoR I。
c. 四個(gè)對(duì)照樣品于
10. 微量離心機(jī)以最大速度離心15min(
11. 用手提式微型探測(cè)器檢查是否所有放射性物質(zhì)均被沉淀。小心吸出乙醇,在空氣中晾干沉淀,然后將DNA溶于29μl TE(pH8.0)。
12. 盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一階段。
[階段4:接頭或銜接子的連接]
cDNA末端的削平
1.cDNA樣品于
2.將cDNA溶液冷卻至
5×T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液 10μl
dNTP溶液,每種5 mmol/L 5μl
加H2O至 50μl
3.加入1~2單位T4噬菌體DNA聚合酶(500單位/ml),
4.加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0),以終止反應(yīng)。
5.用酚:氯仿抽提,再通過(guò)Sephadex G-50離心柱層析,除去未摻入的dNTP。
6.在柱流出液中加入0.1倍體積的3 mol/L 乙酸鈉(pH5.2)和二倍體積的乙醇,樣品于
7.在微量離心機(jī)上以最大速度離心15 min(
接頭-銜接子與cDNA的連接
8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中:
10×T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液 2μl
800~1000 ng的磷酸化接頭或銜接子 2μl
T4噬菌體DNA連接酶(105 Weiss單位/ml) 1μl
10 mmol/L ATP 2μl
混勻后,在
9.從反應(yīng)液中吸出0.5μl貯存于
[階段5:Sepharose CL-4B凝膠過(guò)濾法分離cDNA]
Sepharose CL-4B柱的制備
1.用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進(jìn)1ml滅菌吸管端部,用無(wú)菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去,再用濾過(guò)的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。
2.將一段無(wú)菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連,將吸管寬端浸于含有0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸,直至吸管內(nèi)充滿(mǎn)緩沖液,用止血鉗關(guān)閉軟管。
3.在吸管寬端接一段乙烯泡沫管,讓糊狀物靜置數(shù)分鐘,放開(kāi)止血鉗,當(dāng)緩沖液從吸管滴落時(shí),層析柱亦隨之形成。如有必要,可加入更多的Sepharose CL-4B,直至填充基質(zhì)幾乎充滿(mǎn)吸管為止。
4.將幾倍柱床體積的含0.1 mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后,關(guān)閉柱子底部的軟管。
依據(jù)大小分離回收DNA
5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上層的液體,將cDNA加到柱上(體積50μl或更。,放開(kāi)止血鉗,使cDNA進(jìn)入凝膠。用50μl TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微量離心管,將洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充滿(mǎn)泡沫管。
6.用手提式小型探測(cè)器監(jiān)測(cè)cDNA流經(jīng)柱子的進(jìn)程。放射性cDNA流到柱長(zhǎng)2/3時(shí),開(kāi)始用微量離心管收集,每管2滴,直至將所有放射性洗脫出柱為止。
7.用切侖科夫計(jì)數(shù)器測(cè)量每管的放射性活性。
8.從每一管中取出一小份,以末端標(biāo)記的已知大。0.2kb~5kb)的DNA片斷作標(biāo)準(zhǔn)參照物,通過(guò)1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分析,將各管余下部分貯存于
9.電泳后將凝膠移至一張Whatman
10. 置
11. 在cDNA長(zhǎng)度≥500bp的收集管中,加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和二倍體積的乙醇。于
12. 將DNA溶于總體積為20μl的10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。
13. 測(cè)定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計(jì)算可用于λ噬菌體臂相連接的DNA總量。
[選定組分的總活度值(cpm)/摻入到第二鏈的活度值(cpm)]*2xμg cDNA第二鏈合成量=可用于連接的cDNA
[階段6:cDNA與λ噬菌體臂的連接]
1.按下述方法建立4組連接-包裝反應(yīng):
連接 |
A(μl) |
B(μl) |
C(μl) |
D(μl) |
λ噬菌體DNA(0.5μg/μl) |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
10×T4DNA連接酶緩沖液 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
cDNA |
0 ng |
5 ng |
10 ng |
50 ng |
T4噬菌體DNA連接酶(105 Weiss單位/ml) |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
10 mmol/L ATP |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
加H2O至 |
10 |
10 |
10 |
10 |
連接混合物于
2.按包裝提取物廠(chǎng)商提供的方法,從每組連接反應(yīng)物中取5μl包裝到噬菌體顆粒中。
3.包裝反應(yīng)完成后,在各反應(yīng)混合物中加入0.5ml SM培養(yǎng)基。
4.預(yù)備適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌株新鮮過(guò)夜培養(yǎng)物,包裝混合物做100倍稀釋?zhuān)魅?/span>10μl和100μl涂板,于
5.計(jì)算重組噬菌斑和非重組噬菌斑,連接反應(yīng)A不應(yīng)產(chǎn)生重組噬菌斑,而連接反應(yīng)B、C和D應(yīng)產(chǎn)生數(shù)目遞增的重組噬菌斑。
6.根據(jù)重組噬菌斑的數(shù)目,計(jì)算cDNA的克隆效率。
7.挑取12個(gè)重組λ噬菌體空斑,小規(guī)模培養(yǎng)裂解物并制備DNA,以供適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切核酸酶消化。
8.通過(guò)1%瓊脂凝膠電泳分析cDNA插入物的大小,用長(zhǎng)度范圍500bp~5kb的DNA片段作為分子質(zhì)量參照。