標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系:
10×擴(kuò)增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.1~2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul
PCR反應(yīng)五要素: 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2
引物: 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。
設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基:G C含量以40-60%為宜,G C太少擴(kuò)增效果不佳,G C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補,特別是3"端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3"端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量: 每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物 量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng), 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U(指總反應(yīng)體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應(yīng)配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0~7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2 結(jié)合,使游離的Mg2 濃度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是: 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質(zhì)
結(jié)合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本,可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,
要防止RNase降解RNA。
Mg2 濃度 Mg2 對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2 濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2 濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。