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流式細胞儀檢測細胞凋亡——PI單染色法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

基本原理
  其原理主要是根據(jù)細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變。這些改變包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形態(tài)的改變等,其中細胞核的改變最具特征性,主要包括以下幾個方面:
1. 細胞核的改變:由于凋亡細胞核的改變,造成各種染色體熒光染料對凋亡細胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明,用各種染色體熒光染料對經(jīng)固定的凋亡細胞進行染色,其DNA可染性降低。許多學者把這種DNA可染性的降低認為是凋亡細胞的標志之一。
2. 光散射特性:凋亡細胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀上,前散射光與細胞的大小有關,而側散射光反映的是光在細胞內的折射作用,與細胞內的顆粒多少有關。在細胞凋亡時,細胞固縮,體積變小,故前散射光降低,這一特性往往被認為是凋亡細胞的特點之一。此外細胞凋亡時由于染色體降解,核破裂形成,細胞內顆粒往往增多,故凋亡細胞側散射光常增加。細胞壞死時,由于細胞腫脹,其前散射光增大;側散射光在細胞壞死時也增大,因此可根據(jù)前散射光和側散射光區(qū)別凋亡細胞和壞死細胞。但需要注意的是,根據(jù)前散射光和側散射光判斷凋亡細胞的可靠性受被檢測細胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細胞凋亡中,用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好,而在腫瘤細胞凋亡中,其可靠性就較差。根據(jù)光散射特性檢測凋亡細胞最主要的優(yōu)點是可以將光散射特性與細胞的表面免疫熒光分析結合起來,用以區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細胞亞型。也可用于活細胞的分類。


試劑與儀器
 PBS溶液;
 PI染液:將PI溶于PBS(pH7.4)中,終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。
 70%乙醇
 400目篩網(wǎng)
 流式細胞儀


實驗步驟
1. 收集細胞{數(shù)目約(1~ 5)×106個/mL},500 ~ 1000 r/min離心5min,棄去培養(yǎng)液。
2. 3ml PBS洗滌1次。
3. 離心去PBS,加入冰預冷的70%的乙醇固定,4℃,1—2小時。
4. 離心棄去固定液,3mlPBS重懸5min。
5. 400目的篩網(wǎng)過濾1次,500—1000r/min離心5min,棄去PBS。
6. 用1ml PI染液染色,4℃避光30min。
7. 流式細胞儀檢測:PI用氬離子激發(fā)熒光,激光光波波長為488nm,發(fā)射光波波長大于630nm,產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖。
8. 結果判斷:在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上,凋亡細胞與正常細胞相比,前散射光降低,而側散射光可高可低,與細胞的類型有關;在分析PI熒光的直方圖時,先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發(fā)微弱熒光的細胞碎片,在PI熒光的直方圖上,凋亡細胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0,則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45,可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準,兩者分別為0.35和0.7,可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。


注意事項
  細胞凋亡時,其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一,但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低,或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發(fā)生改變所致。在分析結果時應該注意。

 

 

 
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